论文部分内容阅读
研究背景:糖尿病（diabetes mellitus,DM）是一种全球性疾病,给患者带来极大的身心痛苦及经济负担。中国糖尿病患病率是11.6%（1.139亿人）,而糖尿病前期的患病率为50.1%（4.934亿人）。高血糖是糖尿病的重要特征,血糖的升高与肝脏和外周组织对葡萄糖的利用减少以及肝糖异生增多密切相关。蛋白激酶B（protein kinase B,AKT）是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可引起Ser/Thr磷酸化,具有促进细胞存活及细胞蛋白质合成的作用,同时可促进肝脏组织的分化和生长并且可调节胰岛素介导的糖代谢过程。糖代谢（glycometabolism）途径中的关键酶葡萄糖激酶（glucokinase,GK）特异性地存在于胰腺β细胞和肝细胞,可促进胰岛素分泌和葡萄糖代谢。研究表明,普通糖尿病患者体内GK活性明显降低,而增加GK活性可促进糖原合成并释放胰岛素,进而改善糖耐量异常以及糖尿病症状。因此,提高GK的活性很可能是治疗糖尿病的一种新途径。糖原合成酶激酶-3（Glycogen Synthase Kinase 3,GSK-3）是抑制糖原合成的限速酶,与2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）密切相关。GSK-3β是GSK-3的主要亚型,其高表达与胰岛素敏感性降低相关。抑制GSK-3β活性导致糖原合成酶（glycogen synthetase,GS）去磷酸化促进糖原合成从而达到降低血糖的效果。ras基因是一种属于细胞内信号传导蛋白类原癌基因家族,K-ras是Ras家族成员之一,编码K-ras蛋白。本课题前期研究发现糖尿病模型大鼠肝脏K-ras表达比对照组明显增加,提示肝脏的K-ras与糖尿病的病理变化有关。文献显示激活的AKT可促进肝细胞GK m RNA的表达,AKT还可磷酸化GSK-3β对其产生抑制作用,刺激糖原合成,进而影响血糖水平。本实验观察K-ras小干扰RNA处理对T2DM模型大鼠肝和高糖高脂培养损伤模型肝细胞AKT磷酸化、GK的表达和GSK-3β磷酸化失活的影响,及以上变化与血糖水平、肝糖原生成的关系,进而为糖尿病的肝糖代谢异常的防治提供实验依据。目的:观察K-ras小干扰RNA（si RNA）处理对T2DM模型大鼠肝脏及高糖高脂培养损伤模型肝细胞的AKT磷酸化变化、GK的表达和GSK-3β磷酸化失活的状况,及这些变化与血糖水平和肝糖原合成的关系,为糖尿病肝脏糖代谢异常的防治提供实验依据。方法:1、采用高糖高脂喂养联合小剂量链脲佐菌素（STZ）注射诱导建立T2DM大鼠模型,进行整体水平动物实验。将进行实验的大鼠随机分为五组:正常生理盐水对照组（Ctrl+NS）,糖尿病模型+生理盐水对照组（DM+NS）,糖尿病模型+K-ras小干扰RNA处理组（DM+K-ras si）,糖尿病模型+scrambled si RNA阴性对照组（DM+NC si）,糖尿病模型+二甲双胍（Metformin）阳性药物对照组（DM+Met）。实验观察各组大鼠空腹血糖（FBG）、空腹血胰岛素（FINS）、血脂四项、胰岛素抗性指数（ISI）、肝糖原,并应用蛋白印迹（Western-blot,WB）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）等方法检测各组大鼠肝脏中GK m RNA及蛋白水平和AKT、p-AKT、GSK 3β、p-GSK 3β蛋白水平。2、高糖高脂培养处理大鼠肝细胞建立高糖高脂细胞损伤模型,进行细胞水平实验。将生长良好的对数期大鼠肝细胞接种于6孔板中,分为正常对照组（Ctrl）、高糖高脂处理组（HGHF）、高糖高脂+K-ras小干扰RNA组（HGHF+K-ras si RNA）、高糖高脂+scrambled si RNA阴性对照组（HGHF+NCsi）高糖高脂+空载体阴性对照组（HGHF+Vector）实验应用WB、RT-PCR等方法检测各组大鼠肝细胞中GK m RNA及蛋白水平和AKT、p-AKT、GSK 3β、p-GSK 3β蛋白水平。结果:1、DM+NS)和DM+NC si大鼠空腹血糖（FBG）明显高于Ctrl+NS（P<0.01）;与DM+NS组相比,DM+Met和DM+K-ras si组大鼠FBG均明显降低,差异有统计学意义（P<0.01）,DM+NS组与DM+NCsi组相比没有显著性差异（P>0.05）。2、DM+NS组和DM+NC si组大鼠空腹血胰岛素（FINS）较Ctrl+NS组增加（P<0.01）,与DM+NS组相比,DM+Met组、DM+K-ras si组大鼠FINS明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）,DM+NS组与DM+NCsi组相比没有显著性差异（P>0.05）。3、DM+NS组和DM+NC si组大鼠的总胆固醇（T-CHOL）、低密度脂蛋白（LDL-C）较Ctrl+NS组显著升高（P<0.01）,与DM+NS组相比,DM+Met组、DM+K-ras si组大鼠T-CHOL、LDL-C显著性降低（P<0.01）。DM+NS组和DM+NC si组大鼠的甘油三酯（TG）较对照组升高（P<0.05）,与DM+NS组相比,DM+Met组、DM+K-ras si组大鼠TG下降（P<0.05）。DM+NS组和DM+NC si组大鼠的高密度脂蛋白（HDL-C）较对照组下降（P<0.05）,与DM+NS组相比,DM+Met组、DM+K-ras si组大鼠HDL-C升高（P<0.05）。DM+Met组与DM+K-ras si组各指标相比没有显著性差异（P>0.05）。4、DM+NS组和DM+NC si组大鼠胰岛素抗性指数（ISI）水平显著低于Ctrl+NS组,差异具有统计学意义（P<0.01）,与DM+NS组相比,DM+Met组与DM+K-ras si ISI明显升高（P<0.05）,DM+NS组与DM+NCsi组相比没有显著性差异（P>0.05）。5、DM+NS组大鼠肝糖原低于Ctrl+NS组（P<0.01）,DM+K-ras si组和DM+Met组大鼠肝糖原高于DM+NS组（P<0.01）,DM+NS组与DM+NCsi组相比没有显著性差异（P>0.05）。6、WB检测显示DM+NS组大鼠肝脏中GK、p-AKT、p-GSK 3β蛋白表达水平均低于Ctrl+NS组（P<0.01）,DM+K-ras si和DM+Met组高于DM+NS组（P<0.01）,DM+NS组与DM+NCsi组相比没有显著性差异（P>0.05）。7、RT-PCR检测结果显示,DM+NS组大鼠肝脏中GK m RNA表达水平均低于Ctrl+NS组（P<0.01）,DM+K-ras si组和DM+Met组高于DM+NS组（P<0.01）,DM+NCsi组与DM+NS组相比无显著差异性（P>0.05）。8、WB检测大鼠肝细胞模型实验显示,HGHF组肝细胞GK、p-AKT、p-GSK3β蛋白表达水平均低于Ctrl组（P<0.01）,HGHF+K-ras si组高于HGHF组（P<0.01）,HGHF+NCsi组、HGHF+Vector组相比无显著差异性（P>0.05）。9、RT-PCR检测培养大鼠肝细胞实验显示,HGHF组大鼠肝细胞中GK m RNA表达水平低于Ctrl组（P<0.01）,HGHF+K-ras si组高于HGHF组（P<0.01）,HGHF+NCsi组和HGHF+Vector组与HGHF组相比无显著差异性（P>0.05）。结论:K-ras小干扰RNA处理增加糖尿病损伤模型大鼠肝脏GK表达,提高模型大鼠肝糖原水平,增加GK、AKT、p-AKT、GSK 3β、p-GSK 3βm RNA及蛋白表达。实验结果提示K-ras小干扰RNA可激活AKT可增强GK的表达、增加GSK-3β的磷酸化使其失活,从而可能对糖尿病产生防治作用。