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乳腺癌是仅次于肺癌的严重危害妇女健康的主要恶性肿瘤之一，近年其发病率呈逐年上升趋势。全世界每年约有120万妇女患乳腺癌，尽管随着包括乳腺钼靶摄影、术后系统性辅助化疗等诊断及治疗措施在临床上的广泛应用，乳腺癌的生存率有所提高，但其远期生存率并未得到明显改善，约40％左右的患者在接受术后放化疗后仍然死于肿瘤的转移，这已成为乳腺癌防治中的一大难题。因此，阐明乳腺癌转移的分子机制，对于寻找乳腺癌新的诊治靶点，提高防治水平，延长病人生命具有十分重要的意义。自噬是真核细胞生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。目前研究已证实，细胞自噬主要包括大自噬(macroautophagy， MA)、分子伴侣自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)和小自噬(microautophagy)三种形式。新近，CMA在肿瘤增殖转移中所起的重要作用引起了医学界的广泛关注。有学者报道CMA在肺癌、黑色素瘤等中高表达，并且能够促进肺癌细胞的成瘤和转移作用；另有学者通过7例乳腺癌病人组织，发现LAMP2A表达明显高于癌旁组织，且通过H2O2刺激伴细胞活力检测实验，发现沉默LAMP2A或过表达LAMP2A具有抑制或促进乳腺癌细胞生长的作用，提示CMA可能在乳腺癌发生发展起着重要的作用。但目前国内外有关CMA在乳腺癌增殖中的研究尚不深入，尤其是有关CMA是否与乳腺癌转移有关的研究未见文献报道。本研究采用慢病毒感染基因沉默、质粒转染过表达、免疫荧光、激光共聚焦、荧光定量PCR、Western Blot和关键基因敲除等多种实验方法和技术，通过MTT、克隆形成、Transwell迁移与侵袭、伤口愈合、裸鼠皮下成瘤以及尾静脉乳腺癌细胞肺转移等多种体内外增殖和转移模型，从细胞和动物水平，观察了CMA在乳腺癌增殖转移中的作用及其分子机制。主要研究内容和结果：一、CMA在乳腺癌组织中高表达，且与乳腺癌的分级呈正相关1.通过免疫组化对乳腺癌组织芯片中70例乳腺癌组织和7例正常乳腺上皮进行分析，结果发现，CMA途径中的关键限速蛋白LAMP2A及其主要分子伴侣HSC70高表达于临床乳腺癌标本中，且LAMP2A与HSC70的表达与乳腺癌的分级呈正相关。二、细胞水平上证实CMA促进乳腺癌细胞增殖转移1.通过LAMP2A shRNA慢病毒表达载体感染和LAMP2A过表达质粒转染技术，并采用Western Blot技术进行验证，成功构建了LAMP2A高低表达不同的MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌细胞株。2.间接免疫荧光法结果显示，下调MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌细胞株中LAMP2A表达后，其CMA活性明显降低；反之，应用LAMP2A过表达质粒瞬时转染法上调MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌细胞株中LAMP2A表达后，其CMA活性则明显升高。3.7天MTT增殖曲线结果显示，下调MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌细胞株中LAMP2A表达，能显著降低乳腺癌细胞的增殖能力。4. H2O2刺激伴细胞活力检测实验结果显示，在氧应激条件下，下调MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌细胞株中LAMP2A表达，能显著降低乳腺癌细胞的存活率。5.克隆形成实验结果显示，下调MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌细胞株中LAMP2A表达，能明显抑制乳腺癌细胞的克隆形成。6. Transwell迁移与侵袭实验证实，下调MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中LAMP2A表达后，能显著抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭能力；反之，上调MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌细胞株中LAMP2A表达，则能显著增强乳腺癌细胞迁移和侵袭能力。7.伤口愈合实验结果显示，下调MDA-MB-231中LAMP2A表达，能显著抑制乳腺癌细胞的迁移能力。三、动物模型上证实CMA促进乳腺癌细胞增殖转移1.将LAMP2A高低表达不同的MDA-MB-231细胞，分别接种于裸鼠行皮下成瘤实验，瘤体生长曲线结果显示，接种LAMP2A敲除的MDA-MB-231细胞能显著抑制裸鼠乳腺癌细胞皮下成瘤。2.通过裸鼠皮下成瘤实验，将小鼠肺组织切片并行HE染色，结果发现，接种LAMP2A敲除的MDA-MB-231细胞的裸鼠，其乳腺癌细胞肺转移明显降低。3.通过尾静脉乳腺癌细胞肺转移实验，将LAMP2A高低表达不同的MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌细胞，分别经尾静脉注射入裸鼠体内，通过HE染色观察小鼠肺转移情况，结果发现，接种LAMP2A敲除的MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的裸鼠，其乳腺癌细胞肺转移明显降低。四、CMA抑制乳腺癌细胞大自噬1.采用激光共聚焦证实，下调MDA-MB-231细胞株中LAMP2A表达后，其大自噬标志物RFP-LC3-Ⅱ斑点形成显著增多；MDA-MB-468细胞中未见明显变化。2.采用透射电镜观察发现，下调MDA-MB-231细胞株中LAMP2A表达后，其大自噬泡形成明显增多；MDA-MB-468细胞中未见明显变化。3.采用透射电镜观察发现，接种LAMP2A敲除的MDA-MB-231细胞的裸鼠，其皮下瘤体组织中大自噬泡形成明显增多。4.通过Western Blot技术证实，将LAMP2A高低表达不同的MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞，分别饥饿刺激0h、6h、12h和24h，结果发现LAMP2A敲除的MDA-MB-231细胞中LC3Ⅱ表达明显增强，且与饥饿刺激时间成正相关；在MDA-MB-468细胞中未见LC3Ⅱ表达发生改变。五、CMA促进乳腺癌细胞增殖转移与其抑制ATG5大自噬信号通路有关1.以MDA-MB-231细胞为研究对象，采用qRT-PCR方法对大自噬信号通路关键基因和大自噬相关基因进行筛查，结果显示，LAMP2A敲除的MDA-MB-231细胞中大自噬相关基因ATG5表达水平明显上调。2.通过Western Blot技术对关键基因蛋白表达水平进行验证，结果发现，LAMP2A敲除的MDA-MB-231细胞中，LC3-Ⅱ和ATG5明显增加；而mTORC1信号通路相关分子：p-mTOR Ser2448， Rapter，p-P70S6K Thr389和p-4EBP1Thr37/46未见明显改变，mTORC2信号通路相关分子：p-mTOR Ser2481，Rictor和p-Akt Ser473也未见明显改变。3.通过siRNA技术敲除ATG5，采用H2O2刺激伴细胞活力检测实验证实，ATG5表达降低后，下调自噬活性能逆转敲除LAMP2A对乳腺癌细胞增殖的抑制作用。4.通过siRNA技术敲除ATG5，通过Transwell迁移和伤口愈合实验证实ATG5敲除后能逆转敲除LAMP2A对乳腺癌细胞迁移的抑制作用。5.采用免疫组化和裸鼠皮下成瘤实验，发现接种敲除LAMP2A的MDA-MB-231细胞的裸鼠皮下瘤体组织中，LAMP2A和HSC70明显降低，而大自噬标志蛋白LC3-Ⅱ和自噬相关基因ATG5则明显升高。六、抑制CMA能降低乳腺癌细胞对紫杉醇的耐药性通过MTT实验发现，LAMP2A敲除的MDA-MB-231乳腺癌细胞对紫杉醇药物的敏感性增加。本文结论：CMA促进乳腺癌细胞增殖和转移，其分子机制与抑制ATG5介导的大自噬信号通路有关。本课题为乳腺癌转移的研究提供了新的思路，并为临床乳腺癌的诊治提供新的可能靶点和有益线索。