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LBD (Lateral Organ Boundaries Domain)是高等植物所特有的一类转录因子，该家族成员通常在N-端包含一个保守的LOB结构域。根据序列相似性，植物LBD家族成员可分为ClassⅠ和Class Ⅱ两大类。已有研究结果表明，Ⅰ类LBD成员在侧生器官原基边界表达，控制侧生器官的起始，从而调节植物根、叶、花序、花和胚胎发育。Ⅱ类LBD成员则参与植物花青素的合成以及氮代谢调控过程。穗形态是影响作物产量的重要农艺性状，阐明禾本科植物穗形态建成机制对作物遗传改良具有重要意义。2005年Erik等研究发现，玉米中Ⅰ类LBD成员ramosa2突变会导致雌穗和雄穗高度分枝。本研究组近年来一直从事小麦穗分枝基因定位，并从圆锥小麦中克隆到可能参与穗形态调控的ramosa2同源基因TtRa2。为进一步阐明LBD家族转录因子与靶标DNA的互作机制，本研究以圆锥小麦TtRa2和拟南芥LBD37分别作为Ⅰ类和Ⅱ类LBD家族基因的代表，建立两种LBD家族转录因子及其LOB结构域的高效表达纯化体系，为LBD转录因子晶体的获得和结构的解析奠定基础。另外，本研究也以穗分枝基因初定位结果为基础，开发新的分子标记，为穗分枝基因精细定位奠定基础。本研究主要获得以下研究成果：1.以拟南芥叶片总RNA为模板，通过RT-PCR克隆获得拟南芥Ⅱ类LBD基因AtLBD37完整编码区（753bp），进而通过PCR扩增获得AtLBD37DNA结合结构域AtLBD37-BD（1-372bp）。以已克隆的圆锥小麦Ⅰ类LBD基因TtRa2编码区（774bp）为模板，扩增获得TtRa2DNA结合结构域TtRa2-BD（1-450bp）。2.以表达载体pET21a为基架，设计并构建了pHMT载体，该载体在目标基因上游依次融合了His-tag、MBP和TEV蛋白酶酶切位点。将AtLBD37和TtRa2及其DNA结合结构域分别整合入pHMT获得4种融合表达载体。3.对融合蛋白表达条件进行了优化，最终确定的最佳诱导温度为28℃，在该温度下目的蛋白不仅表达量高，且几乎全部以可溶性状态存在；最佳诱导时间为5h，此时重组蛋白的表达量达到最大且杂蛋白最少。4. TtRa2和AtLBD37及其DNA结合结构域均获得高效可溶性融合表达，融合蛋白约占可溶性蛋白的50~70%。使用直链淀粉柱亲和纯化获得融合蛋白，用融合有His-tag的TEV切除融合蛋白中的His6-MBP双标签，再用Ni-NTA亲和柱去除TEV酶和双标签，最后获得目标蛋白。使用上述流程每升菌液可获得15mg纯度大于98%的TtRa2-BD。5.以分33×中国春F2群体为材料，利用SSR和SNP标记对普通小麦穗分枝基因进行定位，新筛选到一个SSR标记wmc503和一个SNP标记cdo1376，它们与分枝基因的遗传距离分别23.2cM和28.8cM，结合原有标记将普通小麦穗分枝基因定位到2A和2D染色体上的两个位点，距离两位点最近的标记分别为wmc522（8.8cM）和gwm484（15.0cM）。6.以甘A631×甘A1582F2群体为材料，利用SSR标记对四倍体小麦穗分枝基因进行定位，筛选到两个与分枝表型连锁的SSR标记wmc407和wmc198，它们与分枝基因的遗传距离分别为34.2cM和41.1cM。本研究建立了两种LBD转录因子及其DNA结合结构域的高效表达和纯化体系，可为该家族转录因子空间结构解析提供充足的高纯度蛋白。利用六倍体和四倍体两个F2群体，分别筛选到2个与穗分枝基因连锁的分子标记，为后续穗分枝基因的图位克隆奠定了基础。