植物在生长发育过程中面临着多种生物和非生物胁迫,盐胁迫是影响植物生长发育的非生物胁迫之一,是制约农作物产量的重要因素。棉花是全球重要的农作物之一,为纺织工业提供重要的天然纺织原料,棉花被誉为盐碱地的先锋作物,具有良好的耐盐性。随着全球土地盐碱化的加剧,现有栽培品种的耐盐性已不能满足生产需求,因此进一步挖掘棉花的耐盐潜力,培育强耐盐品种,将棉花生产向沿海滩涂及内陆盐碱地区迁移,对缓解我国耕地面积减少、保障粮食安全具有重要意义。研究表明CBL家族和WRKY转录因子家族参与植物的多种非生物胁迫机制,CBL家族成员是依赖Ca2+信号传导的CBL-CIPK调控系统响应外界环境胁迫,WRKY转录因子家族成员是通过转录激活或抑制下游基因的表达来应对外界不利环境。本实验室在前期研究中从野生种旱地棉中克隆得到了两个耐盐相关基因,分别命名为GarCIPK8和GarWRKY17,已在模式作物拟南芥、烟草中转化并验证其耐盐性,结果显示转基因株系与野生型比较,表现出更强的耐盐性。前期本实验室已完成了 Gar CIPK8基因在棉花中的遗传转化,得到T5代3个转基因棉花纯系,已完成GarWRKY17基因的克隆。在此基础上,本研究对转GarCIPK8基因棉花进行了耐盐功能鉴定及耐盐途径的探究,及利用农杆菌介导转化法将耐盐相关基因GarWRKY17转入棉花受体材料R15,完成并完善整个转化过程,得到6个阳性克隆。1.GarWRKY17基因在棉花中的遗传转化利用农杆菌介导转化法用含有目的基因的农杆菌侵染棉花的下胚轴,通过植物组织培养技术获得转GarWRKY17基因植株,对获得的转基因植株进PCR 阳性筛选,最终得到6个克隆共54株转基因棉花。本研究在试验过程中熟练掌握棉花转基因技术整个流程,并优化再生植株的炼苗过程,改进了炼苗的可操作性,提高了转基因再生植株的成活率。2.GarCIPK8基因的耐盐性功能验证将获得的转GarCIPK8基因棉花阳性株系,经过多代自交、纯合、抗性筛选、PCR、RT-PCR鉴定后的纯合株系中选取三个完全纯合的株系,进行萌发期和苗期耐盐性验证。萌发期200 mM的NaCl处理下,受体(R15)与转基因棉花萌发均受到抑制,但是与R15相比,转基因株系在盐胁迫下芽形态变化不明显。苗期300mM的NaCl处理下,R15和转基因株系的生长均受到抑制,但是与R15相比,转基因株系长势更旺盛,根系更加发达,表明GarCIPK8基因可以增强盐胁迫下棉花的耐盐性。为进一步探究GarCIPK8基因的耐盐途径,对300mMNaCl胁迫下分别取转GarCIPK8基因株系和R15叶片中的生理指标进行检测,结果显示,与R15相比,转基因株系中SOD,POD酶活显著提高,MDA含量显著降低,表明GarCIPK8基因通过提高棉花抗氧化胁迫能力,进而提高棉花的耐盐性。对300mM NaCl胁迫下分别取转GarCIPK8基因株系和R15不同时期和不同组织器官(根、茎、叶)进行离子含量的测定,结果显示,在盐处理15天时,转基因株系根中钠积累量低于R15,在茎中钠积累量明显高于R15;转基因株系根中钾积累量高于受体,在茎中钠积累量明显高于受体,结果表明,在盐胁迫下,与R15相比转基因株系受盐害影响更小,表现出良好的耐盐特性。