本项科研工作来源于国家自然科学基金项目(基金号30971328)和高等学校博士学科点专项科研基金项目(基金号20094433110011)。目的和意义支气管哮喘(简称哮喘)是一种气道慢性炎症性疾病,临床表现为反复发作的喘息、呼吸困难、胸闷和咳嗽,伴有气道高反应性和气道阻塞。近20年,全球发达国家哮喘及其它过敏性疾病的发病率普遍上升。世界卫生组织报道：“哮喘对人类健康造成的危害和经济负担超过了结核病和艾滋病的总和。”长期以来,众多学者对哮喘气道炎症和气道重塑的发生机制、影响因素进行了深入研究,发现了哮喘区别于其他疾病的一些特征性改变,如Th2型免疫反应增强、上皮下基底膜增厚、平滑肌增生等等。但是哮喘的起因和发病机制仍未完全清楚。哮喘防治指南推荐的一线治疗措施,表面吸入糖皮质激素,可以有效地控制哮喘症状,但并不能抑制疾病的潜在发展。支气管上皮作为气道内外环境的第一道屏障,不仅通过粘液纤毛系统和机械屏障在气道防御中起重要作用,还通过分泌炎症介质、细胞因子和生长因子等主动参与呼吸道疾病的发病过程。气道上皮损伤和脱落是哮喘的一个重要病理学特征。气道上皮结构和功能的异常导致气道对环境刺激的易感性增高,从而启动和诱发了哮喘的气道炎症和气道重塑,并与哮喘的病理生理表现,如气道阻塞和气道高反应密切相关。气道上皮细胞(Airway epithelial cell, AEC)是气道上皮的主要成分,在上皮结构和功能的维系中担任着主要角色。在过敏原或其它外源性颗粒物质的刺激下,AEC可以分泌细胞因子活化树突状细胞(Dendritic cell, DC),并通过DC促进CD4+T细胞向Th2型炎症细胞转化,启动哮喘的气道炎症反应。接着随着上皮下间充质营养单位(Epithelial mesenchymal trophic unit, EMTU)的活化,AEC可以分泌IL-5、RANTES、eotaxin等细胞因子和趋化因子,维持哮喘气道的慢性炎症。反复损伤激活的AEC还通过分泌TGFβ、VEGF等生长因子,在启动和维持哮喘的气道重塑中发挥着重要作用。因此,增强AEC的防御能力和修复能力,而不仅仅抑制已经发生的免疫反应或炎症反应,可能更有利于哮喘的源头治疗。起源于上皮细胞的胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin, TSLP)是近年研究证实的过敏性炎症的一种重要启动因子。人TSLP主要由变应原接触部位的上皮细胞和基质细胞分泌。具体表现为在哮喘和遗传过敏性皮炎中,TSLP分别由AEC、肥大细胞和皮肤角质细胞产生。而大多数血源性细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞则不表达。TSLP是一种新型的、与IL-7类似的细胞因子,其主要效应细胞是DC细胞。TSLP激活的DCs不能产生利于向Thl分化的细胞因子,而是形成利于Th2产生的微环境。经TSLP诱导的人类骨髓DC能够表达TNF超家族蛋白OX40L,后者能启动诱导Th2细胞产生的信号。同时,Th2型细胞因子作用于AEC后,AEC表达TSLP显著增多。这种正反馈机制可能更好地促进了TSLP的产生和Th2型反应的进行,放大了TSLP的生物学效应。哮喘患者的气管上皮和粘膜下组织中TSLP的表达增加,其表达水平与气道阻塞程度、聚集Th2的趋化因子以及病情的严重程度相关,表明TSLP和人类哮喘有直接的联系。AEC调控TSLP产生和分泌的信号转导机制尚不明确,但转录因子在其中起着重要作用,如核因子κB (Nuclear factor kappa B, NF-κB)、激活蛋白1(Activator protein 1, AP-1)等,应用激素可以抑制某些转录因子介导的调控过程。对哮喘AEC调控TSLP的作用机制及其影响因素进行深入研究,可能寻找出有意义的靶点,为探索哮喘新的更有效的治疗手段提供理论依据和实验基础。环境因素和人们的生活模式在哮喘发病中的作用越来越明确。一个有趣的现象引起了研究者们对维生素D的关注。维生素D缺乏的人群,尤其是怀孕期妇女,其后代哮喘的发病率显著增加；哮喘儿童也存在显著的维生素D缺乏。给怀孕期妇女补充维生素D,其后代哮喘的发病率显著降低；但是出生后儿童补充维生素D,高摄入组儿童的变应性症状反而增加。维生素D与哮喘密切相关,但其参与哮喘发病过程的确切机制并不明确。维生素D3上调蛋白1(Vitamin D3 up-regulated protein 1, VDUP1)最早发现并鉴定于活性维生素D刺激后的HL-60细胞,是一种以维生素D命名的维生素D相关分子。Filby研究绵羊羊胎肺时发现,VDUP1位于支气管和肺泡上皮细胞以及一些间叶细胞,改变肺的膨胀度对肺组织内VDU1mRNA的表达具有显著影响,胎儿肺膨胀诱导VDU1mRNA表达下调,提示VDUP1与肺的发育密切相关。基因组扫描技术证实VDUP1定位于染色体1q21,与复杂疾病如糖尿病、肿瘤、特应性皮炎等相关。VDUP1的作用方式与细胞类型有关,参与调节细胞的增殖、凋亡和分化等环节,是维持细胞内环境稳定的一种多功能蛋白。此外,VDUP1还具有影响自然杀伤细胞(Natural killer cell, NKC)的分化成熟和脂肪代谢的作用。VDUP1作为细胞内的信使分子,可以通过参与调节细胞内的信号通路来发挥其作用。比如,通过抑制原癌基因jun活化结合蛋白1(Jun activating binding protein 1,JAB1),从而抑制转录因子AP-1的活性,介导其抗增殖作用；通过促进凋亡信号激酶1(Apoptosis signal-regulating kinase 1, ASK1)介导其促凋亡作用。多种应激刺激均能激发细胞内的VDUP1活化。目前对VDUP1的研究多局限在细胞的氧化应激方面。因为VDUP1是硫氧还蛋白(Thioredoxin, TRX)的内源性抑制剂,VDUP1的生物学活性主要是通过抑制TRX活性,从而抑制TRX与其它因子的相互作用来完成的。因此又名为TRX结合蛋白2(thioredoxin binding protein-2, TBP2)或TRX相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein, TXNIP)。TRX是细胞内最重要的抗氧化剂之一,属于氧化还原分子,参与调解细胞的氧化应激。有研究显示,VDUP1可以通过染色质修饰作用促进细胞的炎症反应。TRX也不仅在氧化应激中起保护作用,还可以调控细胞的信号转导过程,影响炎性因子的释放。本实验室早期应用抑制消减杂交技术初次筛选并证实,与哮喘患者主要炎症细胞——嗜酸性粒细胞存活、炎症介质释放及肺功能改变明显相关的基因中,VDUP1的表达明显改变。有关VDUP1在哮喘中作用的研究相对较少,但TRX在哮喘中的作用令人鼓舞。急性发作期哮喘患者与稳定期患者相比,其血清TRX显著提高,发作时血清TRX与缓解后相比也显著提高,而且血清TRX水平与患者的呼吸峰流速成反比,提示内源性TRX发挥着保护性作用。外源性TRX可以通过上调Thl型细胞因子的表达而抑制哮喘致敏鼠的Th2型炎症反应及其气道高反应性。更有益的是,外源性TRX不仅可以抑制哮喘致敏鼠的气道重塑,还可以改善业已成形的气道重塑。综上所述,气道上皮在哮喘发病中至关重要,AEC衍生的TSLP是调控哮喘气道炎症方向的重要分子,VDUP1主要通过与TRX的相互作用维持了AEC内环境的稳定,可能参与了哮喘发病的重要环节,但其确切机制尚不明确。因此,进一步明确VDUP1在支气管上皮参与哮喘发病中的作用,系统研究VDUP1在支气管上皮参与哮喘发病中的分子机制,明确它在哮喘气道上皮调控气道炎症中的作用,有利于我们对哮喘发病机制的深入认识。为提高气道上皮的防御能力、免疫调节能力并寻找哮喘治疗更有效的靶点提供理论依据。研究方法(一)建立哮喘动物模型,获取支气管组织,采用real-time RT-PCR方法检测哮喘动物支气管组织VDUP1的表达水平。(二)通过纤维支气管镜活检技术获取哮喘患者的支气管黏膜组织,采用real-time RT-PCR方法检测哮喘患者支气管黏膜VDUP1的表达水平。(三)分离、培养人支气管上皮细胞株。(四)用与哮喘相关的一些环境因素刺激AEC,采用real-time RT-PCR方法检测这些因素对VDUP1表达的影响。(五)通过基因过表达技术在AEC上实现VDUP1过表达,采用real-time RT-PCR和ELISA方法,分别从基因和蛋白水平检测AEC TSLP表达的变化。(六)在证实上述环境刺激对AEC TSLP表达有影响的前提下,通过基因干扰技术在AEC上实现VDUP1基因沉默,同样从基因和蛋白水平检测AECTSLP表达的变化。研究内容和过程一、VDUP1在支气管组织中的表达情况(一)VDUP1在哮喘动物模型支气管组织中的表达1、通过OVA反复致敏,建立哮喘小鼠模型,设立对照组、哮喘组和地塞米松治疗组,观察各组小鼠的症状表现；2、利用动物无创肺功能仪检测小鼠的气道反应性,记录气道反应性指标Penh (P enhance pause);3、获取支气管肺泡灌洗液(BALF),检测其中炎性细胞的分类计数和IL-4水平：4、获取支气管组织,检测VDUP1 mRNA的表达水平；5、结果发现：(1)哮喘模型小鼠出现呼吸困难的症状表现,气道反应性明显升高,BALF中炎性细胞尤其是嗜酸性粒细胞和淋巴细胞增多、Th2型细胞因子IL-4水平增高,病理可见支气管壁增厚、大量炎性细胞浸润,这些改变均符合哮喘的临床特征和病理特征,模型建立成功。(2)哮喘模型小鼠支气管组织中VDUP1 mRNA的水平(2.744±0.99)显著升高,与对照组(1.01±0.18)比较有统计学差异(P=0.020)；应用地塞米松治疗后VDUP1 mRNA的水平(0.94±0.34)明显下降,较哮喘组的差异也具有统计学意义(P=0.015)。(二)VDUP1在哮喘患者支气管黏膜组织中的表达1、确诊哮喘,收集年龄、性别、病史等一般资料,并设立健康对照组；2、检测肺功能,记录FEV1、FEV1/FVC;3、根据肺功能正常与否进行气道激发试验或支气管舒张试验；4、检测血常规、出凝血时间,签署知情同意书；5、通过纤维支气管镜活检技术获取支气管黏膜组织；6、检测VDUP1 mRNA的表达水平；7、结果发现：(1)哮喘患者支气管黏膜VDUP1 mRNA的表达(2.11±1.15)较健康对照组(1.00±0.10)增高,但差异没有统计学意义(P>0.05)。(2)根据患者检测前是否用药将其分为哮喘治疗组和哮喘未治疗组,则哮喘未治疗组支气管黏膜的VDUP1 mRNA水平(2.49±21.62)高于哮喘治疗组(1.72±0.48)。二、与哮喘相关的某些环境因素对AEC VDUP1表达的影响1、分离、培养人支气管上皮细胞株16HBE；2、分别以尘螨抗原提取物(Derp1) 200U/L、甲苯二异氰酸酯-白蛋白复合物(TDI-HSA) 100μg/ml、维生素D (25(OH)D3) 200ng/ml刺激16HBE 6h;3、检测VDUP1 mRNA水平；4、结果发现：Derp1、TDI-HSA、25(OH)D3刺激16HBE后,VDUP1 mRNA的表达均升高(分别为1.69±0.59vs.1、1.56±0.32 vs.1、2.04±0.65 vs.1),与对照组比较均有统计学差异(95%CI分别为1.07-2.31、1.23-1.89、1.36-2.71)。三、AEC内的VDUP1参与哮喘发病的作用机制(一)VDUP1对AEC生长的影响1、构建过表达质粒,转染16HBE；2、应用VDUP1siRNA干扰16HBE VDUP1的表达；3、采用MTT法检测细胞活力变化；4、结果发现：(1)AEC过表达VDUP1后,活细胞比例(71.94±13.72%)明显下降,与空质粒组(100.02±9.20%)比较有统计学差异(P=0.003)。(2)干扰VDUP1后,活细胞比例(109.57±1.93%)增加,与NC组(99.98±4.30%)比较有统计学差异(P=0.002)。(二)过表达VDUP1对AEC TSLP的影响1、用VDUP1过表达质粒转染16HBE；2、检测细胞TSLP mRNA水平和细胞培养上清TSLP浓度；3、结果发现：与空质粒组相比,过表达VDUP1后,AEC内TSLP mRNA水平增高(2.13±0.84vs.1,95%CI:1.25～3.02);细胞培养上清中TSLP的浓度也升高(156.86±77.68 pg/ml vs.60.10±18.45 pg/ml, P=0.048)。(三)不同环境因素对AEC TSLP表达的影响1、分别以Derp1 200U/L、TDI-HSA 100μg/ml、25(OH)D3 200ng/ml刺激16HBE30min、2h、6h、12、24h;2、检测TSLP mRNA水平；3、结果发现：(1)Derp1刺激16HBE 24h中,TSLP的表达没有显著变化(P>0.05)。(2) TDI-HSA刺激16HBE 24h后,TSLP的表达升高,与对照组比较有统计学差异(1.96±0.59vs.1,95%CI:1.35-2.58). (3) 25(OH)D3刺激16HBE 2h和6h, TSLP的表达均升高,与对照组比较有统计学差异(分别为2.38±0.65 vs.1,95%CI：1.70-3.06和1.95±0.55vs.l,95%CI:1.38～2.53),12h后下降(1.88±1.31,P>0.05)。(四)VDUP1干扰对AEC TSLP表达的影响1、应用VDUP1siRNA转染16HBE；2、分别以TDI-HSA 100μg/ml、25(OH)D3 200ng/ml刺激VDUP1干扰后的16HBE 6h,设立阴性对照；3、检测细胞TSLP mRNA水平和细胞培养上清TSLP浓度；4、结果发现：(1)VDUP1干扰后,TDI-HSA诱导AEC表达TSLP mRNA的作用受到抑制(1.19±0.14vs.1.91±0.50, P=0.029)。(2) VDUP1干扰后,维生素D诱导AEC表达TSLP mRNA的作用受到抑制(0.78±0.08 vs.1.74±0.23,P<0.001)；细胞培养上清中TSLP的浓度也下降(55.77±19.88pg/ml vs.141.20±49.05 pg/ml,P=0.008)。主要结论1、支气管上皮VDUP1参与了哮喘的发病,相应的哮喘治疗可能影响气道上皮VDUP1 mRNA的水平。2、常见过敏原(尘螨、甲苯二异氰酸酯)可以促进气道上皮细胞VDUP1的表达。3、气道上皮细胞内的VDUPl通过影响气道上皮细胞的生长和TSLP的表达参与了哮喘的发病过程；4、TDI-HSA通过上调VDUP1的表达而促进气道上皮细胞TSLP的表达,可能是TDI诱发哮喘的机制之一。5、维生素D可以通过上调VDUP1促进气道上皮细胞TSLP的产生。