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一、研究目的急性心肌梗死患病率高,在现代医学标准治疗的情况下,仍有可能出现心力衰竭、心脏破裂等恶性事件。炎性损伤、氧化应激是心肌梗死重要的发病机制,但目前并未有针对性药物。细胞凋亡是心肌细胞坏死的重要形式,也是心肌重构的启动因素。因此早期延缓或抑制心肌细胞凋亡显得尤为重要。中药治疗心肌梗死机制有待揭示,本课题研究目的在于证实益气活血方治疗心肌梗死临床疗效,基础试验探讨其治疗机制。二.研究方法1.临床研究。选择符合急性心肌梗死西医诊断标准及中医辨证为气虚血瘀证型患者60例,分为西药标准治疗组（对照组）,益气活血方+西药标准治疗组（治疗组）,观察两组疗效等级、有效率、中医证候积分;心脏超声检测LVEF,E/Ea,室壁运动积分指数、以及收缩期心内膜向心运动幅度;患者血清NT-proBNP、H-CRP表达;ELISA技术检验治疗组 IL1β、TNF-a、IL-6、ROS、p-FOXO3a 表达水平。2.基础实验（1）益气活血方对H2O2诱导的心肌细胞中炎性因子的影响。首先构建心肌细胞氧化应激模型,采用CCK-8检测双氧水构建模型的最佳浓度。然后采用CCK-8检测益气活血方对细胞活性无影响的最大剂量。ELISA检测益气活血方对心肌细胞培养液中炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6浓度的影响,实验分组正常组,模型组,模型+益气活血低剂量组,模型+益气活血中剂量组,模型+益气活血高剂量组。（2）益气活血方对H2O2诱导的心肌细胞中氧化应激水平的影响。分别采用DHE检测、ROS试剂盒检测益气活血方对细胞ROS水平的影响。采用CAT、MDA、SOD试剂盒检测益气活血方对CAT,MDA和SOD的影响。（3）益气活血方对H2O2诱导的心肌细胞凋亡的影响。细胞流式试验检测益气活血方对心肌细胞凋亡水平的影响。Western-blot检测益气活血方对凋亡通路蛋白水平的影响。（4）Sirt4和p-FOXO3a在H2O2诱导心肌细胞中的表达。Western-blot检测Sirt4和p-FOXO3a在H2O2诱导的新生大鼠心肌细胞中的表达,益气活血方对Sirt4和p-FOXO3a的表达,FOXO3a乙酰化水平的表达影响。（5）益气活血方通过Sirt4/FOXO3a的信号途径对炎性因子的影响。首先构建Sirt4的干扰质粒,采用RT-qPCR技术检测Sirt4的干扰质粒水平。实验分组为正常组,模型组,模型+益气活血方高剂量组,模型+益气活血方高剂量+Sirt4敲减阴性对照组,模型+益气活血方高剂量+Sirt4敲减组,ELISA检测各组炎性因子的表达。（6）益气活血方通过Sirt4/FOXO3a的信号途径对氧化应激水平的影响。实验分组同（5）,DHE检测、ROS试剂盒检测各组ROS水平。CAT、MDA、SOD试剂盒检测各组CAT,MDA和SOD的水平。（7）益气活血方通过Sirt4/FOXO3a的信号途径对细胞凋亡的影响。实验分组同（5）,流式技术检验各组凋亡水平,同时采用蛋白印迹技术检验凋亡蛋白Bcl-2,Bax,BIM,cleaved caspase3的表达。Western Blot检测细胞Sirt4和p-FOXO3a的表达,FOXO3a乙酰化水平的表达。三.研究结果1.临床研究。中医证候疗效分析结果示:治疗组治疗疗效等级及有效率高于对照组,总体积分改善优于对照组,治疗组胸痛、胸闷、心悸、乏力症状改善优于对照组,气短症状两组无统计学差异;心超结果治疗组可显著提高LVEF;E/Ea治疗组、对照组无差异;治疗组可降低NT-ProBNP、室壁运动积分、收缩期心内膜向心运动幅度,优于对照组;两组中H-CRP无统计学差异;ELISA结果总结:益气活血方可以明显降低心肌梗死患者氧化应激水平、升高FOXO3a磷酸化水平,降低IL-1β表达,对TNF-α IL-6无影响。2.基础实验。（1）CCK-8试验结果示25uM的双氧水可以显著抑制心肌细胞的活性,增加心肌细胞的氧化应激损伤,所以选择25uM的双氧水浓度诱导大鼠心肌细胞损伤。益气活血方100ul/ml的给药剂量为最大无毒剂量,所以选择此低剂量为25ul/ml,中剂量为50ul/ml,高剂量为100ul/ml用于后续实验。模型组较正常组炎性因子表达升高,伴随益气活血剂量的增加炎性因子表达逐渐下降。（2）DHE、ROS检测结果示:模型组ROS水平较正常组增高,随着益气活血方剂量的增加ROS的表达水平逐渐下降;模型组MDA的表达水平较正常组增加,并且随着益气活血方剂量的增加MDA的表达水平逐渐下降;模型组SOD,CAT的表达水平较正常组降低,并且随着益气活血方剂量的增加SOD,CAT的表达水平逐渐增加。（3）流式细胞检测结果示:与正常组对比,模型组细胞凋亡的水平增加,随着益气活血方剂量的增加细胞凋亡的水平逐渐下降;模型组Bax,BIM,cleavedcaspas3的表达水平增加,随着益气活血方剂量的增加Bax,BIM,cleaved caspas3的表达水平逐渐下降;模型组Bcl-2的表达水平下降,随着益气活血方剂量的增加Bcl-2的表达水平逐渐增加。（4）WB结果示与正常组相比,模型组中Sirt4、p-FOXO3a的表达下降,FOXO3a乙酰化水平增加;随着益气活血方剂量的增加,Sirt4、p-FOXO3a的表达水平逐渐增加,FOXO3a乙酰化水平逐渐下降。（5）RT-qPCR结果示,质粒干扰可有效降低Sirt4的表达。ELISA检测结果与正常相比,模型组炎性因子TNF-α,IL-1β,IL-6表达增加。与模型组相比,模型+高剂量组炎性因子表达下降。与模型+高剂量组相比,模型+高剂量+Sirt4敲减阴性对照组炎性因子表达不变,模型+高剂量+Sirt4敲减组炎性因子表达回升但是低于模型组。（6）DHE、ROS检测结果与正常相比,模型组ROS表达增加。与模型组相比,模型+高剂量组ROS表达下降。与模型+高剂量组相比,模型+高剂量+Sirt4敲减阴性对照组ROS表达不变,模型+高剂量+Sirt4敲减组ROS表达回升但是低于模型组。CAT、SOD、MDA检测结果:与正常组相比,模型组SOD,CAT表达下降,MDA升高。与模型组相比,模型+高剂量组中SOD,CAT表达增加,MDA下降。与模型+高剂量组相比,模型+高剂量+Sirt4敲减组SOD,CAT、MDA表达不变,模型+高剂量+Sirt4敲减组SOD,CAT表达下降但是高于模型组,MDA表达上升但低于模型组。（7）细胞流式检测结果:与正常组相比,模型组凋亡细胞表达增加。与模型组相比,模型+高剂量组中凋亡细胞表达下降。与模型+高剂量组相比,模型+高剂量+Sirt4敲减阴性对照组凋亡细胞表达不变,模型+高剂量+Sirt4敲减组凋亡细胞表达回升但是低于模型组。WB结果示与正常组相比,模型组Bax,BIM,cleaved caspas3表达增加,Bcl-2表达下降。与模型组相比,模型+高剂量组中Bax,BIM,cleaved caspas3表达下降,Bcl-2表达增加。与模型+高剂量组相比,模型+高剂量+Sirt4敲减阴性对照组Bax,BIM,cleaved caspas3,Bcl-2表达不变,模型+高剂量+Sirt4敲减组Bax,BIM,cleaved caspas3表达回升但是低于模型组,Bcl-2表达下降但是高于模型组。四.研究结论益气活血方可抑制心肌梗死患者炎性损伤以及氧化应激。细胞实验表明益气活血方通过Sirt4/FOXO3a通路保护心肌细胞免于氧化应激的损伤,改善炎症因子水平、并能抑制细胞凋亡。