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p53作为肿瘤抑制关键转录因子(Transcription Factor, TF),在DNA损伤等细胞压力下被激活并介导参与多种肿瘤相关生物学过程,如细胞周期调控、细胞增殖、细胞凋亡、细胞侵袭和迁移等。作为肿瘤抑制因子,野生型p53蛋白通过转录激活或抑制下游与肿瘤相关基因表达,抑制肿瘤的发生发展过程。MicroRNA(miRNA)是一类由21-24个核苷酸组成的内源性小非编码RNA,最近研究已证实miRNA可受p53蛋白直接调控并参与到多个p53调控网络之中。然而,目前在肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)中p53调控miRNA表达谱以及p53-miRNA参与的调控网络尚不清楚。本文利用抗癌药物阿霉素(Doxorubicin, Dox)诱导HepG2细胞DNA损伤,激活p53信号通路。通过小RNA测序(Small RNA sequencing, small RNA-seq)检测阿霉素处理肝癌细胞HepG2前后miRNA的差异表达情况,利用Targetscan、miRanda和’Tarbase软件对miRNA靶基因进行预测,并使用GO与KEGG通路富集方法对差异表达miRNA靶基因进行功能富集分析。随后通过整合分析p53 ChIP-seq与miRNA转录起始位点(Transcription start site, TSS)数据,识别miRNA转录起始位点上游10kb和下游1 kb假定启动子区域是否存在p53蛋白结合位点,筛选出潜在受p53直接调控的miRNAs。最后选择感兴趣并在肝细胞癌中未曾报道的差异表达miRNA进行测序验证,通过qRT-PCR方法检测p53-miRNA表达变化,并利用CCK-8 (Cell Counting Kit-8)检测miRNA对肝癌细胞增殖的影响。结果显示在阿霉素诱导的DNA损伤条件下,HepG2细胞中p53蛋白表达显著上调。经过两次生物学重复小RNA测序,共筛选出33条显著差异表达miRNAs,其中12条miRNAs上调,21条miRNAs表达下调。MiR2Disease疾病功能分析发现其中有8条miRNAs与肝癌细胞的发生发展过程相关。GO和KEGG通路富集分析结果显示87.6%和90.9% miRNAs的靶基因分别参与到p53介导的细胞进程与信号通路中。MiRNA启动子区p53结合位点分析显示,33条显著差异表达miRNAs中有18条miRNAs具备p53蛋白潜在结合位点,其中有7条miRNAs的启动子区域含有多个p53蛋白结合位点,这意味着这些miRNA可能受p53的直接调控。通过qRT-PCR验证肝细胞癌中未曾报道的差异表达miR-3661和miR-4521,结果显示miR-3661表达量上调10.17倍,miR-4521表达量下调6.25倍,与测序结果趋势一致。随后探讨了p53诱导显著上调的miR-3661对HepG2增殖的影响,发现HepG2细胞中过表达miR-3661抑制HepG2细胞的增殖,抑制率为25.7%(P<0.01)。最后构建和分析肝癌细胞HepG2在癌症通路(Pathways in cancer)的p53-miRNA调控网络,并对网络中64条p53-miRNA-mRNA前反馈回路进行了分析。