糖尿病是一组以慢性高血糖为特征的代谢性疾病,长期高血糖状态可导致肾脏的组织损伤、功能障碍和衰竭。在许多国家,糖尿病肾病(DN)已成为导致慢性肾衰的主要病因,在我国DN导致肾衰比率也呈上升趋势。目前认为,DN发生发展机制尚未完全明确,亦缺乏有效的防治方法。因此,进一步探明DN发病机制并寻找延缓DN进展的方法是目前亟待解决的问题之一。目前发现糖尿病微血管病发生过程中多条细胞内信号转导通路(DAG/PKC、MAPK、JAK/STAT)被激活,即高糖可以通过激活多种细胞内信号因子从而导致靶器官损伤。近年有研究提示,Janus激酶/信号转导子与转录激活子(Januskinase/signal transducers and activators of transcription,JAK/STAT)通路与系膜细胞的增殖、肥大及细胞外基质分泌有关。但高糖状态时,STAT家族哪些成员被激活,如何被激活的?哪些因子介导JAK/STATs的病理生理效应?JAK/STAT通路激活对肾脏起什么作用?这些问题有待进一步研究。糖尿病肾病的主要病理变化为肾小球肥大、细胞外基质聚集、基底膜增厚。研究证实转化生长因子-β1(TGF-β1)是引起细胞外基质增多的中介物质,在糖尿病肾病的发生发展中起着关键作用。结缔组织生长因子(CTGF)作为TGF-β1的下游调节因子,介导和调节着TGF-β1的促胶原合成与致硬化作用。而在TGF-β1被阻断的情况下,CTGF也可以直接上调粘连蛋白、胶原在系膜细胞外的积聚,说明除TGF-β1外还有其他途径诱导CTGF的合成及表达。在AGE(糖基化终末产物)诱导NRK-49F(肾脏成纤维细胞)有丝分裂和胶原合成的研究和过氧化物对人晶状体上皮细胞CTGF影响的实验中,发现JAK2/STATs激活可能参与诱导CTGF的表达。但在肾小球系膜细胞,JAK/STAT信号通路的激活是否引起CTGF表达增加尚未见研究报道。RAS系统激活与DN发生发展密切相关。高糖环境可以使细胞内AngⅡ表达增加,而增加的AngⅡ又进一步加强高糖对系膜细胞的作用。AngⅡ可以通过G蛋白偶联的AT1受体引起JAK/STAT通路的活化。高糖和AngⅡ共同存在情况下,是否通过JAK/STAT通路的活化而影响DN的病理生理过程,还有待于进一步研究。为此我们设计了以下实验:1、通过观察高糖培养大鼠肾小球系膜细胞(GMC)p-STAT3的表达变化,探讨糖尿病状态下JAK2/STAT3途径活性的变化。2、通过利用JAK2阻断剂(AG-490)阻断JAK2/STAT3通路和TGF-β1阻断剂(SB-431542)阻断TGF-β1与受体的结合,观察以上两种阻断剂对高糖培养下下系膜细胞TGF-β1、CTGF、FN(纤维连接蛋白)表达的变化,探讨JAK2/STAT3通路与TGF-β1、CTGF之间的相互作用及对细胞外基质分泌的影响。3、通过不同浓度血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激GMC,观察不同时点p-STAT3、TGF-β1、CTGF、FN的表达变化及AG-A90对其表达变化的作用,探讨高糖和AngⅡ共同作用对GMC分泌TGF-β1、CTGF、FN的影响。一、高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞JAK2/STAT3通路活化目的通过观察高糖培养大鼠肾小球系膜细胞(GMC)p-STAT3的表达变化,探讨糖尿病状态下JAK2/STAT3途径活性的变化。方法GMC同步化后分为:正常糖浓度组(含糖5.5mmol/l);高糖浓度组(含糖25mmol/l);甘露醇组(含5.5mmol/l葡萄糖+19.5mmol/l甘露醇);正常糖+AG-490(浓度10μmol/l)组;高糖+AG-490(浓度10μmol/l);继续培养24～48小时后,Western Blot及细胞免疫化学方法检测系膜细胞STAT3、p-STAT3的表达变化。结果高糖培养24和48小时大鼠GMC表达p-STAT3较正常糖浓度对照组明显升高,甘露醇组与正常糖浓度组相比差异无统计学意义;各组之间STAT3表达差异无统计学意义。AG-490抑制高糖下p-STAT3的表达,而对STAT3表达无明显影响。小结高糖通过磷酸化方式激活GMC的JAK2/STAT3信号转导通路,AG-490可以抑制GMC JAK2/STAT3信号转导通路的活化。二、高糖条件下JAK2/STAT3通路活化对大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1、CTGF、FN表达的影响目的利用JAK2阻断剂AG-490阻断JAK2/STAT3通路和TGF-β1阻断剂SB-431542阻断TGF-β1与受体的结合,观察高糖条件下系膜细胞TGF-β1、CTGF、FN(纤维连接蛋白)表达的变化,探讨JAK2/STAT3活化对GMC表达TGF-β1、CTGF及对细胞外基质分泌的影响。方法1、AG-490预处理GMC同步化后分为:正常糖浓度组(N,含糖5.5mmol/l);高糖浓度组(H,含糖25mmol/l);甘露醇组(M,含5.5mmol/l葡萄糖+19.5 mmol/l甘露醇);正常糖+AG-490(N+A,AG-490浓度10μmol/l)组;高糖+AG-490(H+A,AG-490浓度10μmol/l)组。AG-490提前1小时加入,与正常糖或高糖共同培养GMC48小时后,用RT-PCR方法检测系膜细胞TGF-β1、CTGF、FN的mRNA表达,Western Blot方法检测系膜细胞TGF-β1、CTGF表达,ELISA方法检测上清液FN表达变化。2、SB-431542预处理GMC同步化后分为:正常糖浓度组(N,含糖5.5mmol/l);高糖浓度组(H,含糖25mmol/l);正常糖+SB-431542(N+S,SB-431542浓度10μmol/l)组;高糖+SB-431542(H+S,SB-431542浓度10μmol/l)组;SB-431542提前1小时加入,与正常糖或高糖共同培养GMC48小时。培养结束后,用RT-PCR方法检测系膜细胞TGF-β1、CTGF、FN的mRNA表达,Western Blot方法检测系膜细胞TGF-β1、CTGF表达,ELISA方法检测上清液FN表达变化。结果高糖组TGF-β1、CTGF、FN的mRNA及蛋白表达均较正常糖浓度组明显升高;甘露醇组与正常糖浓度组相比差异无统计学意义。与单纯高糖组相比,高糖+AG-490组减少TGF-β1、CTGF、FN的mRNA及蛋白表达,但仍较正常糖+AG-490组有所升高。SB-431542组TGF-β1的表达与高糖组相比无明显区别。与高糖组相比,高糖+SB-431542组CTGF、FN的mRNA及蛋白的表达较高糖组明显减少,但仍较正常糖浓度组有所升高。小结1、抑制JAK2/STAT3通路可以降低高糖诱导的TGF-β1、CTGF、FNmRNA及蛋白的表达,提示JAK2/STAT3信号转导通路可能参与调节GMC的细胞外基质的分泌。2、阻断TGF-β1与受体结合仅部分降低CTGF、FN的表达,提示高糖激活JAK2/STAT3通路在阻断TGF-β1途径后仍可作用于CTGF并参与对细胞外基质的调节。三、高糖和AngⅡ共同培养GMC对JA2/STAT3通路活化作用及对GMC分泌TGF-β1、CTGF及FN的影响。目的在高糖环境中用不同浓度血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激GMC,观察不同时点p-STAT3、TGF-β1、CTGF、FN的表达变化及AG-490对上述指标表达的影响,探讨高糖和AngⅡ共同作用对GMC分泌TGF-β1、CTGF、FN的影响。方法1、系膜细胞在高糖环境中培养48小时后,分别用不同浓度AngⅡ(0、0.001、0.01、0.1、1.0、10μmol/l)刺激GMC30min,及AngⅡ(浓度0.01μmol/l)刺激GMC不同时间(0min～90min),利用免疫细胞化学方法及Western Blot检测系膜细胞p-STAT3表达情况。2、系膜细胞在高糖环境中培养48小时后,AngⅡ(浓度0.01μmol/l)刺激GMC不同时间(0h～24h),RT-PCR方法检测系膜细胞TGF-β1、CTGF、FN的mRNA表达变化,ELISA方法检测系膜细胞培养上清液中FN表达变化。3、高糖环境中提前1小时加入AG-490(10μmol/l),再用AngⅡ刺激GMC6h～24h,观察系膜细胞TGF-β1、CTGF、FN表达的变化。结果1、高糖环境中用不同浓度AngⅡ刺激系膜细胞30min,随着AngⅡ浓度的升高,系膜细胞p-STAT3表达逐渐增强,p-STAT3表达与AngⅡ之间呈现浓度依赖性。2、高糖环境中AngⅡ(0.1μmol/l)刺激5分钟后系膜细胞p-STAT3表达开始增多,并逐渐向细胞核积聚、浓染,发生核移位,刺激30分钟最明显,90分钟后p-STAT3基本恢复到刺激前水平。Western blot结果亦显示同样变化趋势。3、高糖环境中AngⅡ刺激后2小时系膜细胞TGF-β1mRNA表达开始增加,6小达高峰,24小时后恢复到刺激前水平,CTGF、FN亦出现类似改变,但高峰较TGF-β1延迟。系膜细胞培养上清液中FN分泌亦明显增加。4、高糖环境中,提前1小时加入AG-490之后再予AngⅡ刺激系膜细胞6h、8h、12h及24h,AngⅡ诱导的TGF-β1、CTGF及FN mRNA及FN蛋白的表达较未加AG-490组明显减少。小结1、高糖环境中AngⅡ可一过性激活大鼠肾小球系膜细胞JAK2/STAT3信号转导通路,并上调系膜细胞TGF-β1、CTGF及FN的mRNA表达及促进FN分泌。2、阻断JAK2/STAT3信号转导通路可明显抑制高糖和AngⅡ诱导的大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1、CTGF、FN的mRNA的高表达及FN高分泌,提示高糖和AngⅡ在肾小球系膜细胞表达细胞因子、分泌细胞外基质方面可能存在协同作用。结论1、高糖可以激活大鼠肾小球系膜细胞JAK2/STAT3信号转导通路,使其TGF-β1、CTGF、FN mRNA及蛋白的表达增加。抑制JAK2/STAT3通路可以降低高糖诱导的TGF-β1、CTGF、FN mRNA及蛋白的高表达,JAK2/STAT3信号转导通路可能参与调节GMC的细胞外基质的分泌。2、阻断TGF-β1仅部分降低大鼠肾小球系膜细胞CTGF、FN的表达,高糖激活JAK2/STAT3后在阻断TGF-β1途径时仍可使CTGF表达增强,并参与对细胞外基质的调节。3、AngⅡ在高糖基础上进一步激活大鼠肾小球系膜细胞JAK2/STAT3信号转导通路,并使其TGF-β1、CTGF及FN表达增加,高糖和AngⅡ在肾小球系膜细胞表达细胞因子、分泌细胞外基质方面存在协同作用。