在植物进化过程中,多倍化是早已被公认的一种重要力量,是植物进化和新物种形成的重要方式。70%的被子植物在其祖先世代中经历一次或多次多倍化。自然界中存在许多天然的多倍体植物,如同源多倍体紫花苜蓿、马铃薯、桑、甘蔗和葡萄等；异源多倍体棉花、甘蓝型油菜、小麦、菊花、郁金香、咖啡等。基因组加倍使多倍体可用的遗传物质增加,使之可以适应更广泛的自然环境,重复的基因可能会发生功能分化,获得更强的抗旱能力、抗病虫害能力、改变花期和器官大小等,从而使多倍体物种在自然选择中具有更大的优势。人们经常利用新合成的多倍体来模拟多倍体产生的过程,通过多倍体与亲本种进行细胞学、分子生物学、普通遗传学和分子遗传学等各个方面的比较,发现多倍体在许多方面发生了明显的变化,多倍化引起的遗传变异非常复杂,既有可遗传的变异,如染色体重排和序列消除等,也有表观遗传变异,如甲基化、基因沉默、基因激活和small RNA的改变等。small RNAs包括microRNAs (miRNAs)、small interfering RNAs (siRNAs)、trans-acting siRNAs (tasiRNAs)、small nucleolar RNAs(snoRNA)和small nuclear ribonucleic acids (snRNA),它们通过调控目标基因的表达来改变作物表型。但是各种类型的小RNA在多倍体化中发生什么样的变化并且起什么作用,仍然不清楚。甘蓝型油菜(AACC染色体组)是一种重要的异源多倍体油料作物。我国油菜种植面积在1.2亿亩左右,是我国种植面积最大的油料作物,占食用油生产量的45%。甘蓝型油菜的栽培历史只有400多年,遗传基础较狭窄。而中国的白菜和甘蓝栽培历史悠久,资源非常丰富。将二倍体亲本物种甘蓝(CC染色体组)和白菜(AA染色体组)基因资源导入到甘蓝型油菜中能拓宽甘蓝型油菜的遗传基础,具有重要的应用意义。甘蓝和白菜杂交后染色体加倍,可以人工合成甘蓝型油菜,人工合成的甘蓝型油菜会出现非亲本的表型,比如长角果,大叶片等,是什么原因造成这些变异?各类sRNA在甘蓝型油菜的多倍体化过程中起什么作用是本文关心的问题。具体的研究问题如下：(1)在不同的世代,miRNA的变化规律及对靶位点的调控规律是什么?(2)在多倍体化过程中,各种类型的非编码RNA(miRNA, siRNA, snRNA, snoRNA)是否存在相类似的变化规律?(3)多倍体与其亲本种miRNA的差异及靶位点的差异是什么,这些差异对多倍体的进化作用是什么?(4)新合成的多倍体与自然界存在的多倍体的miRNA之间进行比较,是否有明显差异,这种差异是否在多倍体进化过程中起作用呢?本研究采用两种策略来研究小RNA在甘蓝型油菜形成过程中的变异规律。第一种方法,利用人工合成的甘蓝型油菜S1-S4各世代、两亲本物种白菜型油菜和甘蓝的DH系共6个样进行高通量测序,得到了各种不同类型的小RNA,并且进行了分类、定位,比较了亲本与不同世代及不同世代间的miRNA的长度、前体序列、碱基组成、结构、表达模式、靶基因功能等各方面的差异,试图阐述miRNA在甘蓝型油菜多倍化过程中所起的作用。第二种,我们收集已经发表的白菜、甘蓝和甘蓝型油菜miRNA的序列、名称等信息,与第一种已经检测的miRNA合并,建立三个物种的miRNA的合集,分别与三个物种的基因组进行比对,提取邻近序列进行二级结构预测,同时还分析了亲本物种甘蓝、白菜和甘蓝型油菜中miRNA的序列本身的碱基组成规律、长度分布规律及类型差异、一个niRNA调控多个靶基因的和多个niRNA调控一个靶基因的关系。本研究拟回答在甘蓝型油菜的多倍体化产生过程中,miRNA在基因组上的位置、碱基组成、类型、产生miRNA的转座子类型和对靶基因调控等结构和功能上的变异。1亲本物种与人工合成甘蓝型油菜不同世代中sRNA和miRNA变异分析(1)创建了甘蓝与白菜杂交的人工合成甘蓝型油菜不同世代的S群体,代数为S1-S4,群体大小为29个株系,S1采用组培的方式保存,其它采用单粒传方式传递。(2)通过高通量测序,去掉低质量的序列read,甘蓝、白菜型油菜和后代S1-S4代获得的read数目分别为11412769、25393355、47982866、12566574、10029041和16421620个。在人工合成甘蓝型油菜过程中,从P到S1,S1到S2,S2到S3,S3到S4的不同世代传递过程中,Unique sRNAs共同序列比例平均为15.91%,15.87%,18.29%和21.64%,呈现逐步增加的趋势,反映了在多倍体化过程中sRNA序列随着A、C染色体组交换的减少而变异趋势逐步放缓。但从整体上看,UniquesRNAs占总序列的比例非常低,均为25%以下,说明sRNAs在多倍体化过程中发生了巨大的变化。(3)对于总sRNAs序列,从P1-S1,S1-S2, S2-S3, S3-S4的不同世代传递过程中,总sRNAs共同序列比例平均为71.22%、61.88%、70.77%和70.97%,呈现先降低后增加的趋势。(4)甘蓝、白菜型油菜和人工合成甘蓝型油菜的S1-S4样本中已知的和新预测的miRNA分别为2947、3005、3270、3114、3176和3226个。人工合成甘蓝型油菜后代参与表达的niRNA类型要比亲本种的平均值高4.64-9.88%,说明人工合成的甘蓝型油菜中的多倍体化过程促进了miRNA类型的增加。24nt的niRNA类型增加最多,其次为23nt、22nt和21nt miRNA类型。(5)通过对人工合成甘蓝型油菜和亲本物种的miRNA不同位的碱基分析,发现不同位的碱基表现出明显的偏爱性。如第1位碱基偏爱性出现U,第3位碱基容易出现G；第19位极易出现C等。miRNA的首碱基也表现明显的偏爱性。(6)S1-S4中产生miRNA的转座子数目明显高于亲本种甘蓝和白菜,说明在多倍体化过程中诱发了能够产生miRNA转座子的激活,且种间杂交S1代激活最明显,然后在后代中降低。(7)各种小RNA的表达模式有明显差异,miRNA主要表现为加性效应,其次为显性效应和超显性效应,S1特异性的和亲本特异性的模式较少。而剩下的snRNA,snoRNA和来源于exon和intro n的小RNA片段的表达模式主要是亲本特异性和S1特异性表达模式,加性、显性和超显性比较少。(8)在亲本甘蓝和白菜中没有表达而在后代(S1-S4)中表达的miRNA的比例为33.34%；在亲本之中表达,但在后代不表达的比例为6.39%；在亲本和后代都表达的为60.27%。这说明,除开在亲本和后代都表达的1niRNA起主要作用外,新产生的miRNA也起重要作用,而沉默的miRNA在人工合成的甘蓝型油菜产生过程中起着的作用相对较小(9)甘蓝和白菜平均每个miRNA对应的靶基因数目分别为1.2和1.6,而在S1-S4后代中,平均每个niRNA对应的靶基因数目都在3以上,为亲本种平均值的2倍以上,说明在多倍体化后,每个miRNA的调控的靶基因的数目明显增加,增强了多倍体物种的基因表达的调控的复杂性。2亲本物种与传统甘蓝型油菜miRNA变异分析(1)从已经发表的22篇文章里共找到了5104个miRNA,综合前一部分测序后预测到的miRNA,共获得的miRNA为6138个,只在亲本种中检测的miRNA为387个(6.3%),仅在甘蓝型油菜中有的miRNA为80个,占1.3%；在亲本种和多倍体后代中都有的miRNA为5671个(92.4%)。这说明,在甘蓝和白菜中间杂交的后代中,物种特异性的miRNA只占总数的很小比例,而在亲本种和杂交后代中都存在的miRNA占绝大部分。(2)分析芸薹属miRNA的碱基组成,为miRNA的鉴定和预测做好铺垫。通过三个物种的每个miRNA碱基的A、U、G、C碱基组成分析发现,三物种间存在明显差异。总体上看,U碱基的含量明显偏高(33.66%),而G的含量明显偏低(19.97%),剩下的AC含量基本与理论值相符合。AU含量高于GC含量,特别是1和23位AU含量都高于60%,这或许与其功能相关。三个物种的miRNA碱基相比,并没有明显差异,说明关系相近的物种miRNA碱基组成有明显的相似性。另外,所有的miRNA的第一个碱基AU含量(>60%)远高于GC含量,且C碱基的含量明显低于其它类型的碱基含量。(3)在甘蓝、白菜和甘蓝型油菜中,有85%以上的miRNA分布在基因的间隔区；其次为外显子区域(3-7%),在反义链上比正义链上分布更多；分布在内含子区域为2-6%,有义链和反义链上分布的差异不明显；而在重复区域内的比例为1%以下。通过三个物种的miRNA基因组相比较,甘蓝型油菜中的miRNA来源更分散和更广泛。(4)为了剖析重复序列的新功能,将miRNA定位的基因组位点进行了转座子序列的检测。在甘蓝、白菜和甘蓝型油菜中分别检测到425个、247和506个转座子位点中含有miRNA。甘蓝中产生miRNA转座子的数目比白菜中对应的数值高72%,说明甘蓝型油菜产生过程中,能产生miRNA的转座子数目在多倍体化后数目增加,可能是多倍体化后miRNA数目增加的一个原因。(5)甘蓝型油菜中miRNA调控的靶基因数目明显增加,表现为较低的调控网络(如一个miR NA调控7个以下靶基因的数目)的比例下降,而超过一个miRNA调控25个靶基因以上的调控网络有明显增加。这说明在多倍体化后,miRNA调控靶基因的数目增加,增强了多倍体miRNA调控的复杂性。综上,在甘蓝型油菜产生的多倍体化过程中,各种类型的小RNA发生了较大变异,从低世代到高世代呈现逐步稳定的趋势,miRNA主要表现为加性效应,其次为显性效应和超显性效应,新表达的miRNA在人工合成的甘蓝型油菜产生过程中起着重要作用。在多倍体体化后,与亲本种相比,多倍体的miRNA的数目、产生miRNA的转座子数目和miRNA调控的靶基因数目均有明显增加,从而使甘蓝型油菜的调控多样性更加复杂,可能是多倍体物种对外界环境的适应能力增强的原因之一。