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缺血性脑卒中在发展中国家致死性疾病中排第三位,是造成永久性残疾的最主要原因之一。随着人类寿命延长,其发病率有明显升高趋势,并成为致残致死的主要原因。该病的发生发展是由基因和环境等多种因素共同作用所致,但其复杂的发病原因和发病机制目前尚不甚明了。因此,对其致病原因、病理生理过程及梗死脑组织保护的研究就显得尤为重要。Micro RNAs是一类长度约22~25个核苷酸的内源性单链非编码小RNA。其生物合成过程是分别通过Drosha和Dicer利用RNA聚合酶2和核糖核酸3(Rnase3)进行核内外转录,并借助碱基互补配对的方式与信使RNA的3’非编码区(UTR)结合,形成RNA诱导沉默复合体,导致转录抑制或者信使RNA降解。自从1993年miRNAs首次在线虫类秀丽隐杆虫幼虫的生长发育过程中被发现,已经有超过1600种miRNAs被记录在miRBase数据库中。近期,已经在体内外检测到脑缺血的micro RNAs表达谱。miRNA微列阵检测技术作为micro RNA筛查手段,检测出脑缺血前后miR-185的表达变化,并发现脑缺血可能会导致miR-185的表达上调。而β淀粉样前体蛋白结合蛋白1(Apba-1)作为一个神经相关蛋白已经在阿尔兹海默病中被广泛的研究。既往研究通过同位素相对标记与绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,i TRAQ)检测技术证实了Apba-1在脑缺血前后的表达水平可能存在变化。但miR-185和Apba-1表达水平在脑缺血中的确切变化和他们之间是否存在调控关系尚未研究清楚。本研究在成功建立原代神经元细胞OGD模型和SD大鼠大脑中动脉梗塞(MCAO)模型的前提下,探索在脑缺血再灌注损伤中miR-185和Apba-1表达水平的具体变化,并进一步研究Apba-1在脑缺血再灌注损伤中的表达变化是否受miR-185的调节。实验一生物信息学方法预测miR-185的分子调控通路目的:运用生物信息学方法预测miR-185作为脑缺血调控基因的可能性及其可能的上下游靶基因。方法:通过pubmed文献检索系统检索得到可能与脑缺血相关的micro RNAs,运用UCSC基因组浏览器、人类miRNA疾病数据库、TF-miRNA调控数据库、Target Scan6.2预测micro RNAs与疾病的相关性和其上游转录因子及下游靶基因。结果:pubmed文献调研提示miR-185与多种疾病的病理生理过程密切相关,其中包括缺血性脑卒中疾病中的炎性反应、离子转运、氧化应激等过程。UCSC数据库中显示miR-185在人类、恒河猴、小鼠、狗、大象中具有高度保守性。TF-miRNA调控数据库和Target Scan 6.2显示miR-185被转录因子EGR1调控并可能调控与神经系统疾病相关的21个下游基因的表达,其中以Apba-1与miR-185关联性最强。结论:生物信息学方法预测了miR-185与缺血性脑卒中有相关性,同时预测了Apba-1可能是其下游靶基因,为进一步深入研究提供扎实的理论基础。实验二miR-185和Apba-1在OGD所致皮层原代神经元损伤前后表达量变化的研究目的:探索OGD所致皮层原代神经元细胞损伤前后miR-185和Apba-1表达量的变化。方法:培养皮层原代神经元细胞并利用MAP2染色鉴定神经元培养情况;构建皮层原代神经元细胞OGD模型;利用CCK8实验检测最适宜的糖氧剥夺时间;利用实时定量聚合酶链式反应(QRT-PCR)检测miR-185及Apba-1在m RNA水平上的表达变化。结果:MAP2染色鉴定培养的皮层原代神经元,结果显示神经元生长良好,培养成功,可用于后续实验;CCK8检测结果显示:OGD 1h组约有20%的神经元细胞凋亡,OGD 2h组约有50%-55%的神经元凋亡,说明OGD模型建立成功且OGD 2h细胞损伤程度适合;QRT-PCR结果显示:在细胞OGD 2h后分别复氧复糖0h、12h、24h,检测miR-185的表达量均明显高于正常细胞(P<0.05),并且miR-185的表达量随着复氧复糖时间的延长呈递增趋势,而Apba-1的表达量均明显低于正常细胞(P<0.05),并且Apba-1的表达量随着复氧复糖时间的延长呈递减趋势。结论:miR-185和Apba-1在OGD损伤前后表达存在明显差异,并随复氧复糖时间延长呈相反趋势表达。实验三miR-185和Apba-1在大鼠MCAO模型前后表达量变化的研究目的:探讨miR-185与Apba-1在大鼠MCAO模型前后的表达差异。方法:将雄性SD大鼠60只随机选择10只为假手术组,其余给予线栓法大鼠大脑中动脉梗塞(MCAO),将存活并且按Garcia评分法进行神经功能评分差值≤3分的30只大鼠随机分成三个实验组(术后1d组、3d组、7d组),每组10只;QRT-PCR检测各组大鼠脑组织miR-185和Apba-1 m RNA的表达;western blot法检测Apba-1蛋白的表达水平。结果:与假手术组比较,miR-185 m RNA在各实验组相应脑组织中的表达量明显升高(P<0.05),且表达量随再灌注时间延长在各实验组间呈逐渐上升的趋势(P<0.05);Apba-1 m RNA和蛋白在各实验组脑组织表达量明显降低(P<0.05);且表达量随再灌注时间延长在各实验组间呈逐步下降的趋势。结论:miR-185和Apba-1在大鼠MCAO模型前后均存在表达差异,并随时间变化呈相反趋势表达。实验四miR-185和Apba-1调控关系的研究目的:探索miR-185和Apba-1在脑缺血再灌注损伤中的调控关系。方法:克隆Rno-miR-185和Rno-Apba-1的序列,并连入表达载体构建报告基因质粒,使用菌落PCR鉴定质粒构建情况;利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-185和Apba-1之间的调控关系。结果:菌落PCR鉴定质粒构建成功。miR-185直接作用于Apba-1 3′-UTR的预计靶位点调控Apba-1的表达。结论:miR-185可以负性调控Apba-1在脑缺血中的表达。