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新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是一种单股、不分节段、含有囊膜的负链RNA病毒,能够引起禽类新城疫(Newcastle disease,ND),给全球养禽业带来巨大的经济损失。NDV的致病性主要是由病毒的融合蛋白裂解位点(Fusion protein cleavage site,Fcs)氨基酸序列决定的。一般情况下,强毒和中等毒力毒株的Fcs包含多个碱性氨基酸,基序(Motif)为“R/K-R-Q/R/K-R/K-R↓F”;弱毒株Fcs则包含1个或2个碱性氨基酸,基序为“G/E-K/R-Q-G/E-R↓L”。Fcs中的氨基酸种类、性质及其所处的位置因毒株的不同而呈现一定的多样性。虽然已有报道Fcs中单个或多个氨基酸的突变会影响诱导细胞融合能力及病毒的致病性。但是,Fcs中所呈现的氨基酸序列多样性对病毒的影响至今不明。另外,有研究发现,虽然一些毒株的Fcs中氨基酸序列一致,但对诱导细胞融合能力及宿主的致病性有较大差异,说明除了Fcs外,F蛋白其它区段或位点的氨基酸也起着重要的作用。因此,本研究针对Fcs的氨基酸序列通过分析其多样性,分别以强毒株和弱毒株的F基因为骨架,构建Fcs突变体,利用体外细胞实验,探索Fcs的氨基酸序列多样性及特殊Fcs情况下F蛋白其它区段对诱导细胞融合能力的影响。具体研究内容及结果包括以下几个方面:1.NDV自然分离株Fcs氨基酸序列多样性的广泛性分析通过GenBank数据库及文献报道收集了1572株NDV的相关信息,利用软件Lasergene7.1对Fcs氨基酸序列多样性进行统计分析,我们将Fcs分为强毒Fcs(VFcs)和弱毒Fcs(AFcs)2大类,VFcs包含1073个毒株,AFcs包含499个毒株。其中,将VFcs又分为8种类型,毒株基本都属于Class II类基因型;将AFcs分为10种类型,毒株大多属于Class I类基因型,部分属于Class II的基因型I、II和X。通过分析毒株的流行病学,我们发现Fcs与禽的种类、时空分布之间存在显著的关联性,其中一些Fcs类型具有禽类种属依赖性及地域特性。2.Fcs氨基酸序列多样性对F蛋白诱导细胞膜融合能力的影响利用NDV强毒株F48E9和弱毒株La Sota的F蛋白为骨架,将其Fcs氨基酸序列分别突变为10种AFcs和8种VFcs,通过将F突变体和HN质粒共转染BHK-21细胞观察对诱导细胞膜融合活性的影响。结果显示,在VFcs中,当P3位是谷氨酰胺(Q)时,该F蛋白能显著提高细胞融合活性。在连续5个碱性氨基酸情况下,赖氨酸(K)对于细胞融合活性的增强起着重要的作用。VFcs-1和VFcs-2是F蛋白诱导细胞膜融合活性最强的两种类型,VFcs的8种类型对促细胞膜融合活性的作用依次为:VFcs-1、-2>VFcs-3、-4>VFcs-5、-6、-7、-8。在AFcs中,无胰蛋白酶存在时,除AFcs-10类型外,其它几种类型均不能引起合胞体产生;有胰蛋白酶存在时,除了含有P4位为中性氨基酸Q的AFcs-9类型的F蛋白不能诱导细胞膜融合现象,其它均产生程度相似的细胞膜融合效率。3.Fcs为“RRQRR↓L”的F蛋白其它区段对诱导细胞膜融合能力的影响在对Fcs氨基酸序列多样性研究时发现,Fcs“RRQRR↓L”为弱毒裂解位点(AFcs),通常认为拥有AFcs的无论强毒株还是弱毒株F蛋白都不能有效诱导细胞膜融合,但是,我们发现拥有此Fcs的强毒株F48E9的F蛋白具有很高的细胞膜融合诱导能力,而拥有此Fcs弱毒株LaSota的F蛋白不能有效诱导细胞膜融合。此结果表明除了Fcs,强毒株F蛋白的其它区域触发了细胞膜融合。为了寻找此F蛋白的具体作用区域,我们将F蛋白的主要功能域划分成9个区段,然后将这些区段在强、弱毒株F蛋白之间进行相互替换,通过细胞转染实验分析F蛋白突变体之间对宿主细胞膜融合效率的影响,并根据鉴定结果进一步进行替换或突变,最终明确了在Fcs为“RRQRR↓L”时,F48E9-F蛋白上影响细胞膜融合能力的2个关键氨基酸,即D479,S486。4.一种检测NDV诱导细胞融合新方法的建立NDV感染可引起宿主细胞合胞体的产生,其诱导细胞融合的程度可作为一种衡量毒力强弱的指标。目前对细胞融合程度进行评估时,普遍采用人工计算合胞体中细胞核的平均数量的方法对其进行判定。此法虽然比更早采用的计算合胞体面积判断法要更精确,但费时费力,主观性强易出现较大的误差。为了探索更方便、有效的定量检测NDV诱导细胞融合效率的方法,本研究运用慢病毒转导技术成功筛选出两种荧光细胞系BHK-21/GFP和BHK-21/tRFP。将此两种细胞等比例混合后感染病毒,通过流式细胞技术检测形成合胞体(双荧光阳性)的数量来判定细胞的膜融合效率。结果表明,在不同剂量的NDV感染混合细胞系后,双荧光阳性细胞数所占比例能很好地反应出病毒感染剂量与形成合胞体数量之间的线性关系。本研究为开发方便、有效的定量检测细胞融合效率提供了新的技术手段。综上所述,本研究较为详细的阐明了NDV Fcs氨基酸序列多样性对细胞融合活性的影响,为研究Fcs氨基酸序列多样性对宿主致病性提供必要的理论依据。其次,除Fcs外,F蛋白其它区域在诱导细胞膜融合能力方面也起着重要作用,为NDV F蛋白触发的细胞膜融合作用提供了新的见解,并为设计抗病毒多肽药物提供了理论基础。