黄曲霉毒素解毒酶基因的克隆与表达研究

来源 :内蒙古农业大学 | 被引量 : 16次 | 上传用户:popularmp3007008
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黄曲霉毒素(Aflatoxin)主要是由黄曲霉与寄生曲霉产生的一种毒性极强的次级代谢产物,其中黄曲霉毒素B1(AFB1)是所有黄曲霉毒素中毒性最强的,可以诱发癌症,其分子稳定性高,很难被破坏。如何快速有效的去除谷物、饲料中的AFB1受到人们越来越多的关注。比较降解黄曲霉毒素AFB1的途径,生物学方法去毒具有更温和、更高效的特点。   黄曲霉毒素解毒酶能够以黄曲霉毒素B1(AFB1)为底物,破坏其有毒基团,生成无毒物质。但目前对黄曲霉毒素解毒酶的研究工作报道很少。本研究意在克隆黄曲霉毒素解毒酶基因,分析它的生物学功能,为黄曲霉毒素解毒酶的工业化生产提供基础数据。研究工作的主要内容如下:   1.克隆得到2088bp的黄曲霉毒素解毒酶基因。   2.将黄曲霉毒素解毒酶基因与大肠杆菌表达载体pET-30a 连接,在大肠杆菌表达菌株 Rosetta(DE3)中进行胞内表达。经优化培养条件,确定其最佳诱导温度为20℃、最佳IPTG诱导浓度为0.1mmol/L、最佳诱导时间为8h。通过Western blot检测,在近77KD处有特异条带,确定所表达产物为目的蛋白,经酶活检测,去毒率为11.185%,酶活力为33.53×10-3U/g3.将黄曲霉毒素解毒酶基因与毕赤酵母表达载体pPIC9K-6HisEn-5’(实验室构建)连接,在毕赤酵母表达菌株GS115中进行分泌表达,通过Western blot检测,在近77KD处有特异条带,确定表达产物为目的蛋白。经酶活检测,去毒率为25.52%,酶活力为1.76 U/g。
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