癫痫是一种常见的神经系统疾病,其特征是长期的癫痫发作易感性,并由此产生神经生物学、认知、心理和社会后果。颞叶癫痫(temporary lobe epilepsy,TLE)是成年和老龄人群中最常见的耐药型难治性癫痫,其病因和临床表现有很大差异。通过反复、短暂电刺激边缘系统而建立的点燃模型一直被用作TLE的模型,扩展点燃(extended kindling)能够诱发动物出现自发、重复性癫痫发作(spontaneous recurrent seizures,SRS)。扩展点燃后的SRS发生通常与严重的脑损伤无关,而与海马门区γ-氨基丁酸能(γ-aminobutyric acid,GABA)中间神经元亚群的丢失有关。扩展点燃后的动物缺乏可见的严重脑损伤,这与癫痫持续状态(status epilepticus,SE)后伴有明显脑损伤的SRS模型不同。因此,扩展点燃模型可能有助于探索无明显脑病理学改变的情况下SRS的发生机制,这见于临床上许多影像学阴性的TLE患者。以往的资料对于扩展点燃的啮齿动物模型中SRS的脑电图(electroencephalogram,EEG)特征性研究有限。本实验采用扩展电点燃小鼠海马CA3区,建立自发、重复性癫痫发作(SRS)模型,观察SRS发生后在体/离体颞叶相关神经网络的电生理特征及联系,以及SRS对海马依赖性学习记忆的影响,并对其中可能的电生理机制进行了探讨,以期对抗癫痫治疗方法提供新的思路。本实验研究内容共分为三部分,各部分内容分述如下。第一部分单侧海马CA3区扩展电点燃癫痫模型构建目的:采用每日2次的重复电刺激,刺激小鼠单侧海马CA3区,直到出现稳定的SRS,构建无明显脑损伤的小鼠扩展电点燃癫痫模型。通过观察和分析电刺激后放电(afterdischarges,ADs)、海马CA3区电生理信号、评估动物行为学及SRS,总结模型制备过程及EEG信号长期记录的经验,提高该模型成功率,为后续进一步研究癫痫发生机制奠定模型基础。方法:取健康成年雄性C57BL/6小鼠30只作为实验对象,随机分为点燃组和对照组,每组15只。2组分别在双侧海马CA3区置入双极电极。1周后将小鼠置于特制EEG监测笼中,采用改良后的栓系EEG记录方法采集EEG基线信号,保证记录过程中小鼠能够自由活动。随后测定点燃组小鼠ADs阈值,根据阈值对点燃组小鼠进行扩展点燃电刺激程序。点燃程序结束后2-3天开始长程EEG-视频信号采集,收集SRS发作期EEG信号及发作间期海马CA3自发及诱发性电生理信号,并分析SRS同步的动物行为变化。对照组小鼠每天抓取处理两次,持续60天,不进行电刺激。结果:(1)点燃组SRS癫痫模型构建:点燃组共有11只小鼠达到“点燃”状态即出现SRS;点燃成功率(点燃成功例数/总纳入实验例数):73.33%。所有对照组小鼠无SRS和发作间期放电现象。(2)EEG监测状态下小鼠行为学观察:监测状态下,滑环下方的可旋转电极记录线未出现缠绕、扭曲及置入电极脱落情况,小鼠能够自由移动、饮水及进食,表现为能进行梳理毛发、用后腿直立或前爪挖地等自然行为。(3)SRS评估:9天连续EEG监测下共观察到点燃组7只共≥114次的Racine 3-5级SRS。(4)海马CA3区电生理信号:(1)组间比较:分析2组生理状态下θ节律及在运动/探索、静止/睡眠行为中发生的较大不规则活动(large irregular activity,LIA)功率,结果显示两组间无统计学差异(p>0.05)。(2)组内比较:(1)与自身点燃前(pre-kindling)相比,点燃后小鼠(post-kindling)诱发性突触场电位显著增强,且在不同刺激强度(10μA起始,间隔10s递增10μA,最大150μA)下均有增强(P<0.01);(2)与点燃前(pre-kindling)相比,点燃后(post-kindling)小鼠ADs波幅增高,持续时间延长,点燃前后ADs事件下总面积(波幅×持续时间)分别为70.33±17.74mv.ms和174.53±44.50mv.ms,组内比较差异具有统计学意义(p<0.05);(3)与点燃前(<0.4个/min)相比,点燃后发作间期棘波(1.77±0.95个/min)数量明显增多,具有统计学意义(p<0.05);(3)点燃组6只动物注射咪达唑仑后ADs与SRS明显被抑制(p<0.001)。(5)脑组织病理学评估:海马区的电极轨迹与设定的立体定位坐标完全匹配。海马及其他脑区未见明显结构变形、空洞或深染疤痕等明显病变。结论:(1)小鼠海马CA3区扩展电点燃能够建立可靠、稳定的SRS癫痫模型。(2)SRS的出现与颅内电极置入和长期人为抓取处理无关。(3)实验采用的电极置入及记录方法安全、稳定,能够提供高质量的EEG资料并保证长期监测效果。第二部分单侧海马CA3区扩展电点燃癫痫模型与学习记忆相关性研究目的:构建中老年小鼠海马CA3区扩展电点燃癫痫模型,观察该模型对海马依赖性学习记忆、神经精神行为的影响。方法:经Morris水迷宫训练合格的11-12月龄健康雄性C57BL/6小鼠30只随机分为2组,点燃组和对照组,每组各15只。按照第一部分的实验方法构建海马CA3区扩展电点燃SRS癫痫模型。造模后分别对2组进行Morris水迷宫实验及旷场实验。Morris水迷宫实验分为可视平台试验3d、隐蔽平台试验5d(每日固定时间4次)及在隐蔽平台试验的第3日及第5日进行空间探索实验(各1次),持续60秒,观察试验过程中各组小鼠游泳距离、逃避潜伏期,穿越目标象限次数及在目标象限停留时间。旷场实验只进行1次,持续1h,观察动物在敞箱内总静态或移动计数、总活动距离、总直立或中心直立计数、总活动计数及活动时间(静态、移动和直立活动时间)。结果:(1)可视平台试验:与对照组相比,点燃组小鼠的游泳总距离(运动轨迹)(F(1,22)=28.161)明显增加,逃避潜伏期(运动轨迹)(F(1,22)=30.671)明显延长,差异具有显著统计学意义(p<0.001)。(2)隐蔽平台试验:对照组小鼠游泳总距离及逃避潜伏期随时间变化呈下降趋势(F(4,88)=2.770,p<0.05),而点燃组无时间相关性下降趋势(F(4,88)=1.888,p>0.05);与对照组相比,点燃组小鼠的游泳总距离(F(1,22)=17.280)明显增加,逃避潜伏期(F(1,22)=17.086)明显延长,差异具有显著统计学意义(p<0.001)。(3)空间探索试验:与对照组相比,点燃组小鼠穿越目标象限次数明显减少(F(1,22)=10.704和9.210),差异具有统计学意义(p<0.01);在目标象限的游泳距离明显缩短(F(1,22)=7.505;quadrant(F(3,66)=3.151),差异具有统计学意义(p<0.05);在目标象限的停留时间明显减少(F(3,66)=3.815),差异具有统计学意义(p<0.05);(4)旷场实验:2组总活动次数、总活动时间及距离方面无明显差异;与对照组相比,点燃组的静态计数及静态时间明显减少,差异具有统计学意义(p<0.05);两组总直立次数无差异,但与对照组相比,点燃组中心直立次数明显少(p<0.05)。结论:(1)海马CA3区扩展电点燃癫痫模型小鼠表现出海马依赖的学习记忆缺陷。(2)海马CA3区扩展电点燃后小鼠表现出明显的焦虑行为。第三部分单侧海马CA3区扩展电点燃癫痫模型在体/离体神经网络电生理特征分析目的:构建海马CA3区扩展电点燃癫痫模型,从在体/离体电生理的角度,分析不同脑区神经网络在癫痫发生过程中的电生理特征,进一步探讨癫痫发生可能的机制。方法:实验动物分为点燃组和对照组。点燃组选取一侧海马CA3区作为电点燃部位,另外选取一个非点燃部位作为记录点与点燃侧CA3区同步记录电生理信号。按记录电极放置位置不同进一步分为:对侧CA3区亚组、同侧顶叶皮层亚组、对侧顶叶皮层亚组、同侧内嗅皮层亚组、同侧梨状皮层亚组、对侧背内侧丘脑亚组。每个亚组10只。按照第一部分实验程序构建海马CA3区电点燃模型。对照组小鼠每天抓取处理两次,持续60天,不进行电刺激。造模成功够,进行以下实验程序:1、观察抗癫痫药物(antiepileptic drugs,AEDs)对SRS的影响;2、在体SRS评估、发作期及发作间期EEG信号分析;3、处死动物并快速获取离体脑切片,标准ACSF下观察海马CA3区和齿状回群峰电位(population spikes,PS)、双脉冲刺激效应、自发性尖波(spontaneous sharp waves,SPWs)、CA3区锥体神经元细胞内参数、兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic currents,EPSCs)、抑制性突触后电流(inhibitory postsynaptic currents,IPSCs);碱性ACSF下观察不同脑区诱发性类发作样事件及类发作间期样事件。各组实验数据行统计学分析。结果:(1)点燃组共47只小鼠,平均每只小鼠≥8个SRS事件的现象。对照组10只小鼠在抓取处理60天后无运动性发作及EEG放电现象出现。(2)不同脑区电极置入后SRS评估:点燃组各亚组引起SRS所需电刺激次数为105.3±8.7至121.7±7.7之间,ADs总持续时间为2900.7±211.2至3311.7±127.5s,诱发性运动性发作总的Racine分数为355.9±14.9至433.7±22.8。早期SRS发生率为7.6±0.7 to9.6±0.8次/日,各亚组间无统计学差异(p>0.05)。终止电刺激后2-3日记录的早期SRS发生率与8-11周后记录的发生率分别为8.64±0.57和6.97±0.40次/日,晚期发作频率轻微下降,但无统计学意义(p>0.05)。(3)SRS电生理特征:(1)点燃侧海马CA3区发作期放电与非点燃部位不同脑区的发作期放电同步出现;发作期放电持续时间在点燃侧海马与对侧海马(48.4±0.8和47.5±0.8s)、点燃侧海马与同侧顶叶(44.5±1.0和45.2±0.8s)、点燃侧海马与对侧背内侧丘脑(54.8±3.0和55.4±3.0s)之间无明显差异(p>0.05);点燃侧海马与同侧梨状皮层(46.1±1.0和41.6±0.9s)/点燃侧海马与同侧内嗅皮层(43.2±0.6 vs.40.5±0.5)相比,发作期放电持续时间稍有延长,具有统计学意义(p<0.05)。(2)各脑区发作起始期放电形式表现为低波幅快节律(low-voltage fast signals,LVF)。(3)多数发作期脑电信号与运动性癫痫发作有关,对侧CA3区亚组运动性发作Racine分级为3.25±0.10,同侧顶叶皮层亚组3.54±0.10,对侧顶叶皮层亚组3.19±0.11,同侧内嗅皮层亚组3.54±0.11,同侧梨状皮层亚组3.60±0.06,对侧背内侧丘脑亚组3.36±0.08。(4)AEDs对于SRS的影响:phenytoin(PHT)\acetazolamide(ACZ)\levetiracetam(LEV)干预后,SRS的发生率显著降低(p<0.05),发作期放电持续时间无明显变化(p>0.05),对应的运动性癫痫分级评分也无差异(p>0.05);劳拉西泮干预后,SRS的发生率无明显变化(p>0.05),但运动性癫痫分级评分明显降低(p<0.05);valproate(VPA)干预后,SRS的发生率显著降低(p<0.05),对应的运动性癫痫分级评分明显下降(p<0.05);VPA、ACZ劳拉西泮干预后,发作期放电持续时间有轻微缩短,但缩短后发作期放电在点燃侧海马和未点燃的梨状皮层/顶叶皮层区域仍同步出现(持续时间分别为10.7±0.8s和10.5±0.8s),且发作起始始终表现为LVF型为主。(5)小鼠脑片自发/诱发性电生理信号特征:(1)两组CA3和齿状回PS幅度和波形无明显统计学差异(p>0.05);(2)与对照组相比,点燃组的双脉冲抑制效应(paired-pulse inhibition)明显减弱(p<0.05);(3)两组CA3区锥体细胞静息膜电位、动作电位阈值、动作电位半宽、动作电位幅度无明显统计学差异(p>0.05),但点燃组的膜输入电阻较对照组降低,差异具有统计学意义p<0.05);(4)与对照组相比,点燃组CA3区自发节律性事件频率减少且变得更加不规则,IPSCs减少而EPSCs增多(p<0.001),在EPSCs和IPSCs的电荷转移和间隔上没有显著的组间差异,但在点燃组小鼠中,可检测到向外IPSCs的神经元比例较小(p<0.001)。(5)与对照组相比,点燃组在CA3区记录到的SPWs更小,频率更低(p<0.001)。点燃组在-40mV时与SPWs相关的外向IPSCs电荷转移较少,而在-60mV内向EPSCs电荷转移较多,组间比较具有统计学差异(p<0.001);(6)在40mv至-85mv范围内钳夹神经元,记录连续诱发的4~5个IPSCs平均值以测量IPSCs峰值,结果显示2组神经元之间的IPSCs没有显著差异(p>0.05);(7)在碱性人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)诱导下,在点燃组的CA3区、梨状皮层、内嗅皮层均观察到类发作期样放电,其中梨状皮层的类发作期样放电较CA3区和内嗅皮层更多(p<0.001)。同等条件下,对照组所有被检测脑片均未记录到类发作期样放电(p>0.05),但在CA3区、梨状皮层及内嗅皮层均观察到与点燃组相同脑区相似的类发作间期样棘波,其发生率明显低于点燃组(棘波间期(p<0.001)。结论:(1)不同部位电极置入不是SRS发生的主要影响因素。(1)本模型中SRS出现后发生率保持稳定。(2)受试的AEDs(除劳拉西泮外)对SRS的启动有明显抑制作用,但颞叶局部神经网络对这些AEDs的抑制不敏感;(3)点燃后小鼠切片容易产生类发作样放电,但这种易感性并不局限于电刺激点燃侧的CA3区。(4)实验结果支持本模型中以LVF发作型为特点的SRS发生是由多个前脑区域组成的复杂神经网络同时或同步启动完成。