论文部分内容阅读
目的利用体外实验研究丹灯通脑胶囊含药脑脊液对氧糖剥夺/复糖复氧（Oxygen Glucose Deprivation/Reoxygenation,OGD/R）损伤大鼠脑微血管内皮细胞（Brain Microvascular Endothelial Cells,BMECs）的保护作用以及其保护作用是否与调控Wnt/β-catenin信号转导通路有关,为丹灯通脑胶囊治疗缺血性脑中风提供药理学依据。方法1.丹灯通脑胶囊含药脑脊液对OGD/R损伤模型大鼠BMECs的保护作用1.1采用微量进样器经硬脊膜穿刺法制备丹灯通脑胶囊含药脑脊液;1.2大鼠BMECs的原代培养、鉴定及OGD/R损伤模型的建立;（1）对新生的SD大鼠进行BMECs的原代分离培养;（2）形态学观察和Ⅷ因子相关抗原免疫荧光鉴定法对BMECs进行鉴定;（3）采用内部配备有缺氧小室的培养箱（95%N2、5%CO2）和无糖DMEM培养液结合的方法建立BMECs的OGD/R损伤模型;1.3CCK-8法筛选丹灯通脑胶囊含药脑脊液对BMECs的最适浓度;1.4倒置相差显微镜对各组BMECs的细胞形态变化进行观察;1.5采用CCK-8法观察各组BMECs的细胞活力;1.6通过Millicell ERS-2细胞电阻仪测定BMECs的TEER值来判断丹灯通脑胶囊含药脑脊液对OGD/R损伤后的BMECs的通透性变化影响;1.7分别采用硝酸还原酶法和酶联免疫吸附法检测丹灯通脑胶囊含药脑脊液对OGD/R损伤后的BMECs血管活性物质总NO含量和ET-1含量的影响;1.8酶联免疫吸附法检测丹灯通脑胶囊含药脑脊液对OGD/R损伤后的BMECs纤溶系统活性物质t PA和PAI-1含量的影响。2.基于Wnt/β-catenin信号转导通路研究丹灯通脑胶囊含药脑脊液对OGD/R损伤大鼠BMECs的保护作用机制2.1Real-Time PCR技术检测BMECs Wnt/β-catenin信号通路上LRP-6、Axin2、β-catenin、GSK-3βm RNA的表达水平;2.2Western-Blotting法检测Wnt/β-catenin信号通路上的β-catenin、GSK-3β蛋白表达。结果1.丹灯通脑胶囊含药脑脊液对OGD/R损伤模型大鼠BMECs的保护作用（1）原代培养的BMECs接种在培养瓶后,于倒置显微镜下可见呈现出串珠样单枝或分枝状的脑微血管片段。培养3天后更换培养液,倒置显微观察其形态可见短梭形或多角形细胞从贴壁的微血管段周围长出,呈区域性单层生长,10天左右逐渐融合形成紧密连接的“铺路石”样结构单层生长,并呈“旋涡状”分布。接着将细胞传代制作爬片,进行Ⅷ相关抗原免疫荧光法鉴定,细胞的胞质呈绿色,细胞核经DAPI复染为蓝色。此结果表明所培养的细胞为BMECs。（2）脑脊液的浓度筛选实验结果显示,丹灯通脑胶囊含药脑脊液的浓度在10%时具有较好的细胞保护作用,因此我们选择10%的丹灯通脑胶囊含药脑脊液的处理浓度用于后续实验。（3）倒置显微镜观察可见:OGD/R模型对照组BMECs出现不同程度地变小、变圆、脱落,且细胞的突触缩短变细,细胞间隙明显增大,排列疏松;而丹灯通脑胶囊组和尼莫地平对照组则可见BMECs的形态明显改善,贴壁细胞数增多,脱落数减少,少量胞体收缩变圆,细胞间隙也有所减小。（4）实验结果显示,OGD/R可使大鼠BMECs的活力下降,丹灯通脑胶囊增强了受损BMECs的细胞活力。（5）与OGD/R模型对照组相比,丹灯通脑胶囊组可显著性增加受损的BMECs TEER值,降低内皮细胞的通透性。（6）与OGD/R模型对照组相比,丹灯通脑胶囊组可有效增加细胞上清液总NO的含量。与OGD/R模型对照组相比,丹灯通脑胶囊组的ET-1含量的升高有所减少。（7）与OGD/R模型对照组相比,丹灯通脑胶囊组可明显地增加t PA的含量,促使纤溶能力增强,进而减轻OGD/R对BMECs造成的损伤。与OGD/R模型对照组相比较,丹灯通脑胶囊组可显著性降低PAI-1的含量。2.基于Wnt/β-catenin信号转导通路研究丹灯通脑胶囊含药脑脊液对OGD/R损伤大鼠BMECs的保护作用机制（1）Real-Time PCR技术检测Wnt/β-catenin信号通路中的基因表达水平结果显示,与OGD/R模型组相比较,丹灯通脑胶囊组Axin2 m RNA、LRP-6 m RNA、β-catenin m RNA的相对表达量均明显升高,而GSK-3βm RNA相对表达量呈现出明显的下降趋势;DKK-1抑制剂和丹灯通脑胶囊合用时,与丹灯通脑胶囊单用组相比Axin2 m RNA、LRP-6 m RNA、β-catenin m RNA的相对表达量均有所降低,GSK-3βm RNA的相对表达量则显著上升。（2）Western-Blotting法检测Wnt/β-catenin信号通路中蛋白的表达结果显示,与OGD/R模型组相比较,丹灯通脑胶囊可显著上调β-catenin蛋白的表达,下调GSK-3β蛋白的表达。当DKK-1抑制剂和丹灯通脑胶囊合用时,与丹灯通脑胶囊单用组相比,β-catenin蛋白的表达有所下降,GSK-3β蛋白的表达则有所升高。结论研究结果表明,OGD/R可致大鼠BMECs损伤,丹灯通脑胶囊含药脑脊液可以增强受损BMECs的活力,降低内皮细胞的通透性,增加舒血管物质NO的含量,减少缩血管物质ET-1的含量,还可以降低PAI-1含量,增加t PA的含量,使纤溶能力增强,继而减轻OGD/R对BMECs所造成的损伤,说明丹灯通脑胶囊含药脑脊液对BMECs具有一定的保护作用。通过分子机制研究显示,这种调节作用可能与调节Wnt/β-catenin信号通路有关,即丹灯通脑胶囊含药脑脊液能够激活Wnt/β-catenin通路,对OGD/R损伤后的BMECs有所改善,进而发挥其保护作用。