研究背景腱骨愈合一直是骨科、运动医学和组织再生领域的研究难点。腱骨连接部是肌肉将力量传导到骨骼的重要结构,是由软组织到硬组织过渡的特殊结构,由于应力集中容易发生断裂,使腱骨连接部损伤成为运动损伤中最常见的疾病之一。由于腱骨愈合中腱骨界面形成大量的瘢痕组织,生物力学强度远低于正常水平,临床上腱骨连接部损伤术后的再断裂率较高,增加了治疗的负担。因此,促进腱骨愈合仍然是运动医学领域面临的一个巨大挑战。腱骨连接部组成结构复杂,由渐变的四层结构组成:骨组织、钙化的纤维软骨层、非钙化的纤维软骨层和肌腱。这四层结构是梯度变化的,力学特性也逐渐发生变化,在力学传导中避免了应力的集中。然而愈合过程中在腱-骨界面形成大量的瘢痕组织代替了纤维软骨层,而腱骨愈合过程中纤维软骨层的形成与腱骨愈合的质量密切相关。腱骨连接部的发育过程中纤维软骨层发育不良将导致力学强度降低,在损伤愈合中抑制腱骨界面纤维软骨的形成导致力学性能下降。因此,腱骨愈合中促进纤维软骨形成是提高愈合的质量的关键。炎症反应参与腱骨愈合过程,愈合早期局部有大量M1巨噬细胞浸润,分泌大量促炎因子以增强局部的炎症反应,刺激细胞的分裂、趋化成纤维细胞聚集受损部位。随后巨噬细胞极化为M2型,分泌大量抗炎因子以降低局部炎症反应,促进组织再生和修复。研究表明在很多组织的愈合中,M2型巨噬细胞通过分泌多种细胞因子促进组织的修复。然而,在腱骨愈合中巨噬细胞作用研究鲜有报道,巨噬细胞对腱骨愈合的作用仍然不清楚。多项研究发现使用干细胞、物理治疗能促进腱骨愈合,并发现这些干预措施都促进了愈合部位M2巨噬细胞增多。因此,我们推测在腱骨愈合中M2型巨噬细胞发挥着重要的作用。腱骨愈合中纤维软骨形成是影响愈合的关键,但巨噬细胞对腱骨愈合中纤维软骨形成的作用不清。在关节中巨噬细胞是影响软骨修复和成软骨分化的重要炎症细胞。在软骨的修复中缺乏巨噬细胞导致软骨的修复失败。M1型巨噬细胞在软骨的再生和修复中起着负性的作用,它能抑制软骨基质生成基因的表达,分泌的促炎因子和基质金属蛋白酶会诱导软骨细胞的退化,加速软骨的退变。在软骨修复进程中,M0型巨噬细胞向M2型转化有助于受损软骨的修复,M2型巨噬细胞分泌IL-10、TGF-β3等因子具有很强促进软骨修复或促成软骨分化的作用。目前为止,没有研究报道不同类型巨噬细胞对腱骨愈合中纤维软骨形成的作用,但在腱骨愈合中M1型巨噬细胞分泌的促炎因子导致大量的瘢痕形成,阻碍了纤维软骨形成。因此,我们推测在腱骨愈合中M2型巨噬细胞可能通过分泌细胞因子促进纤维软骨的形成。因此,本研究旨在探明巨噬细胞在腱骨愈合中的作用和机制。我们首先建立了腱骨愈合模型,分析愈合过程中巨噬细胞转变与界面纤维软骨形成的关系。接下来通过清除愈合中巨噬细胞分析缺乏巨噬细胞对腱骨界面纤维软骨形成及生物力学性能的影响。接下来通过局部诱导巨噬细胞向M2型极化,探讨M2型巨噬细胞对腱骨愈合中纤维软骨形成和对生物力学的影响。然后通过基因测序、PCR等方法筛选M2型巨噬细胞促进腱骨愈合的目标因子,并验证M2型巨噬细胞是否通过分泌该因子促进腱骨愈合。最后,我们采用BMSCs外泌体调节腱骨愈合中巨噬细胞向M2型极化,观察对腱骨愈合中纤维软骨形成和生物力学的影响。研究目的1.明确腱骨愈合中巨噬细胞变化与纤维软骨形成的关系。2.阐明M2巨噬细胞对腱骨愈合和纤维软骨形成的作用。3.探明腱骨愈合中M2型巨噬细胞促进纤维软骨形成的机制。4.研究BMSCs外泌体对腱骨愈合中巨噬细胞极化和腱骨界面纤维软骨形成的作用。研究方法1.明确腱骨愈合中巨噬细胞变化与纤维软骨形成的关系我们通过建立腱骨愈合模型,收集不同时间点标本,采用免疫荧光染色和PCR分析不同时间点巨噬细胞表型的转变,采用免疫荧光染色和PCR分析不同时间点界面纤维软骨形成的规律,分析腱骨愈合中巨噬细胞表型转化与纤维软骨形成的关系。通过建立腱骨愈合模型,在愈合过程中清除巨噬细胞,观察对腱骨界面纤维软骨形成的影响,分析缺乏巨噬细胞对愈合后生物力学的影响。2.阐明M2巨噬细胞对腱骨愈合和纤维软骨形成的作用首先,我们构建小鼠腱骨愈合模型,通过局部注射IL-4/13诱导巨噬细胞向M2型极化,通过组织学、免疫荧光染色等评价腱骨界面纤维软骨变化,采用生物力学评价M2型极化巨噬细胞对愈合的影响。3.探明腱骨愈合中M2型巨噬细胞促进纤维软骨形成的机制首先,我们通过流式细胞术分选腱骨愈合中的M1和M2型巨噬细胞,通过测序筛选出具有调控干细胞成软骨分化的细胞因子,通过PCR和ELISA验证和进一步筛选,然后验证M2型巨噬细胞是通过分泌TGF-β3促进腱骨界面纤维软骨形成。4.研究BMSCs外泌体对腱骨愈合中巨噬细胞极化和腱骨界面纤维软骨形成的作用从BMSCs中分离出外泌体,与水凝胶混合后局部注射到腱骨愈合部位,观察BMSCs外泌体对腱骨愈合过程中巨噬细胞的影响及对腱骨愈合的作用。研究结果1.腱骨愈合过程中巨噬细胞变化与纤维软骨形成有关发现术后第3天界面组织内以M1型巨噬细胞为主,术后第7天以M2型巨噬细胞为主,促进成软骨分化的因子在术后第7、10天表达增多,术后14天开始有纤维软骨形成;在腱骨愈合中清除巨噬细胞导致愈合部位细胞因子减少,细胞外基质形成减少,界面纤维软骨形成显著减少,导致愈合后生物力学强度降低,表明腱骨愈合过程中巨噬细胞与纤维软骨形成具有相关性。2.腱骨愈合中巨噬细胞向M2型极化促进腱骨界面的纤维软骨形成,提高了生物力学性能腱骨愈合过程中M2型巨噬细胞极化后,组织中具有促进成软骨分化的因子(TGF-β3、TGF-β1、IGF-1)也显著增加,促进了腱骨界面纤维软骨形成,从而提高生物力学强度。体外研究表明M2巨噬细胞能促进BMSCs成软骨分化。3.腱骨愈合中M2型巨噬细胞通过分泌TGF-β3促进腱骨界面纤维软骨形成筛选出腱骨愈合中M2型巨噬细胞分泌大量的TGF-β3,通过验证表明在腱骨愈合第7天M2型巨噬细胞出现最多时,组织中检测到TGF-β3表达增加。ELISA检测显示腱骨愈合中分选出的M2型巨噬细胞分泌大量TGF-β3。体内研究表明重组TGF-β3能显著增加腱骨界面纤维软骨的形成,而TGF-β3中和抗体抑制了纤维软骨的形成。4.BMSCs外泌体诱导巨噬细胞向M2型极化促进腱骨愈合界面纤维软骨形成在腱骨愈合中,BMSCs外泌体能调节巨噬细胞向M2型极化,减少促炎因子生成,增加细胞因子生成,促进腱骨界面的纤维软骨层的形成,提高生物力学强度。研究结论和意义本课题较为全面的阐述了巨噬细胞在腱骨愈合中的作用和机制。首先通过分析发现腱骨愈合中巨噬细胞与纤维软骨形成具有相关性,然后证明腱骨愈合中清除巨噬细胞不利于纤维软骨形成,降低了生物力学性能,接下来通过诱导腱骨愈合中巨噬细胞向M2型极化,发现M2型巨噬细胞能促进腱骨愈合中纤维软骨形成。然后通过筛选和验证证明M2巨噬细胞是通过分泌TGF-β3促进纤维软骨形成。最后发现BMSCs外泌体在腱骨愈合中可调节巨噬细胞向M2型极化,从而促进纤维软骨形成,提高生物力学性能。通过本研究,我们发现了巨噬细胞在腱骨愈合中的作用以及M2型巨噬细胞促进纤维软骨形成的机制。我们的研究结论为促进腱骨愈合提供了科学依据,为临床提高腱骨愈合强度提供了治疗策略。