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相关背景:人胰岛因子1(islet1,ISL1)作为重要的转录因子参与多个下游靶基因的表达,它在种属间具有高度的保守性,其编码的氨基酸序列在人与大鼠中完全一致。在胚胎时期ISL1参与了心脏及胰腺还有部分神经细胞的分化和发育,出生后它在胰岛细胞和神经细胞中也有不可或缺的作用。之前关于ISL1基因的研究的热点主要集中在其下游靶基因方面,国内已有学者进行了小鼠ISL1基因启动子的研究并确定了小鼠ISL1启动子的转录起始位点及其顺式作用元件,但国内外尚无对人ISL1基因启动子的研究,因此本人所进行的研究主要是针对人ISL1基因启动子及其调控机制方面。目的:克隆并鉴定人胰岛因子1基因启动子区和其核心功能区域,探讨糖皮质激素及缺氧刺激对ISL1转录活性的调控,验证糖皮质激素及缺氧刺激对人胚肾293细胞(human embryonic kidney 293,HEK293)细胞的凋亡作用方法:利用基因信息数据库预测人ISL1基因启动子区的DNA序列,采用PCR方法克隆出含有ISL1基因启动子区及其截短片段的质粒,分别将不同片段长度的质粒转染至HEK293细胞中,利用双荧光素酶报告系统检测不同长度片段的启动子活性并确定其最小活性区域;Genomatix在线网站预测最小启动子活性区域可能存在的转录因子结合位点并且发现其中存在缺氧诱导因子1结合位点和糖皮质激素反应元件;利用缺失突变技术及双荧光素酶报告系统检测地塞米松磷酸钠对ISL1基因启动子活性的影响并验证糖皮质激素反应元件是否为其作用位点;利用实时定量PCR(Real time quantitative PCR,RT-qPCR)及蛋白质印迹(Wesetern blot)技术检测地塞米松磷酸钠及缺氧刺激对ISL1基因mRNA水平以及蛋白水平的表达的影响;利用细胞流式仪检测地塞米松磷酸钠及缺氧刺激对HEK293细胞凋亡的影响。结果:测序证实成功构建有活性的含人ISL1基因启动子序列的质粒,生物信息学方法预测在其最小活性区域内存在糖皮质激素反应元件(glucocorticoid response element,GRE)及缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)结合位点;地塞米松磷酸钠可增加含有糖皮质激素反应元件的ISL1启动子质粒在HEK293细胞中的启动子活性,但对不含糖皮质激素反应元件的缺失突变质粒在HEK293细胞中的启动子活性;在HEK293细胞中加入地塞米松磷酸钠后ISL1基因mRNA及蛋白的表达均增加,以5%氧浓度缺氧刺激HEK293细胞24小时和48小时后,HIF-1基因和ISL1的mRNA表达水平均增加,与在21%的常氧环境培养相比,5%氧浓度缺氧刺激HEK293细胞48小时可使ISL1蛋白表达中有所增加;1mg和2mg的地塞米松磷酸钠以及5%氧浓度缺氧刺激24小时均可使HEK293细胞的凋亡率增加。结论:成功构建在HEK293细胞中有启动子活性的含有人ISL1基因启动子序列的质粒;地塞米松磷酸钠和5%氧浓度缺氧刺激均可促进人ISL1基因mRNA和蛋白水平的表达;地塞米松磷酸钠和5%氧浓度缺氧刺激均可诱导HEK293细胞的凋亡。