本课题组在组织工程化周围神经方面作了许多研究，在SD大鼠和食蟹猴身上证实了经过Triton X-100和Deoxycholate处理的同种异体神经修复2cm以上的神经缺损取得较为理想的效果。由于人体神经与SD大鼠、猴相比相对粗大，并且神经大小差异悬殊；人体神经周围结缔组织更丰富，经过化学处理的时间和程序可能也需要作出相应改变。目前文献与本课题组研究均未涉及到人源性同种异体去细胞神经材料的特殊性，故其制备方法的标准性必须对制备条件进行重新比较研究来予以确定，标准化的制备方法是进行临床生物安全性检测与临床验证之必不可少的路径。并且目前所研究的去细胞同种异体去细胞神经材料多是基于大鼠或猕猴的动物模型材料，对于人源性材料，究竟其内在结构、组织成分、超微结构有什么特点，其相应的生物学行为相关性有哪些均为研究空白；而这些研究空白的填补，对于人体运用时其生物安全性、有效性的评估，甚至作用机制的阐明均有积极和不可缺少的意义。 因此，本实验拟在本课题组以往实验和参考国内外相关文献的基础上，通过采用不同流程处理新鲜截肢肢体取得的神经，再对处理后神经进行大体、HE、Hoechst染色、免疫组化、TEM、电泳和蛋白测定等检测，确定制备人源性去细胞同种异体神经材料的标准工艺流程，为临床神经缺损的患者提供可促神经再生的理想移植材料；并对按标准制备的不同规格的人源性去细胞神经材料结构差异性与残留物安全性进行比较研究，以利于临床安全有效的应用。 材料和方法： 1.不同化学萃取流程制备出人源性去细胞同种异体周围神经材料并对其各项观察指标比较分析 1.1以人体神经为材料，在本课题组以往实验和参考国内外相关文献的基础上，设计各种不同流程，制备出人源性去细胞同种异体周围神经材料。 实验一共分为六组： 第一组：神经组织PBS液泡洗2h→3％Triton X-100振荡12h→PBS洗3次，每次5min→4％脱氧胆酸钠振荡24h→PBS洗3次，每次5min→上述步骤重复1次。 第二组：神经组织PBS液泡洗2h→3％Triton X-100振荡24h→PBS洗3次，每次5min→4％脱氧胆酸钠振荡24h→PBS洗3次，每次5min→上述步骤重复1次。 第三组：神经组织PBS液泡洗2h→3％Triton X-100振荡24h→PBS洗3次，每次5min→4％脱氧胆酸钠振荡24h→PBS洗3次，每次5min。 第四组：神经组织PBS液泡洗2h→3％Triton X-100振荡12h→PBS洗3次，每次5min→4％脱氧胆酸钠振荡12h→PBS洗3次，每次5min→上述步骤重复1次。 第五组：神经组织PBS液泡洗2h→125mM SB-10振荡15h→PBS洗3次，每次5min→0.6 mM SB-16 and0.14％Triton X—200振荡24h→PBS洗3次，每次5min→上述步骤重复一次。 第六组：未萃取的新鲜神经作为对照。 1.2对制备的上述人源性去细胞同种异体周围神经材料进行各种检测，通过统计学分析，确定结构保存和细胞成分去除综合起来最合适的标准流程。 观察指标： (1)大体形态： Fontana横纹，大小，塌陷程度。 (2)HE染色和细胞核染色(Hoechst染色)：了解雪旺细胞残留程度及神经大体结构的完整性。 (3)免疫组化：anti—laminin反映基底膜；anti—collagenⅠ了解神经内膜完整性；anti—neurofilament反映轴突；anti—S-100反映雪旺细胞。 (4)髓磷脂碱性蛋白(MBP)测定：Western免疫印迹法。 (5)凯氏定氮法测定制备的人源性去细胞同种异体神经材料的蛋白比例。 (6)TEM观察了解基底膜结构完整及轴突和雪旺细胞、髓鞘残留程度。 2.标准制备的不同规格的人源性去细胞神经材料结构差异性与残留物安全性进行比较研究。 2.1不同规格的人源性去细胞同种异体周围神经材料经过标准的化学萃取流程制备后的结果分析。 把人体神经依据粗细分为1.5±0.5cm和5.0±1.0cm两组，长度均为2cm，均经过第一部分中确定的标准萃取流程处理，制备成人源性去细胞同种异体神经材料。 将制备的材料分别进行HE和Hoechst染色、免疫组化(包括LN、NF、S-100和ColⅠ)以及TEM观察，比较其基底膜结构的保存完整性和雪旺细胞、轴突去除的程度。 2.2人源性去细胞同种异体周围神经材料制备后清洗液量和次数对萃取剂残留浓度的比较。 选取一组制备材料，分别用神经与清洗液体积比为1:100和1:300的PBS液冲洗5遍，每遍留取5ml作MS、LC/MS测定萃取剂(Triton X-100和脱氧胆酸钠)残留浓度。 结果： 1.萃取后的各组神经其直径和长度均稍大于化学萃取前的新鲜神经，颜色呈乳白色半透明状，神经大体轮廓仍完整，质地较前疏松，神经外膜白色条纹结构消失；在空气中无塌陷，较易粘着；牵拉各种方法制备去细胞同种异体神经，其延展性均较化学萃取前略增加。其中第二组大体较其它组结构更疏松，韧弹性稍差，可在无张力下行常规的神经吻合。 2.HE和Hoechst染色可见第二组髓鞘和细胞核去除最彻底，其它各组去除均有不同程度的残留。其中萃取一次组残留最多，Triton X—200组仍残留髓鞘和细胞核碎片位于萃取一次组、萃取12h组之间。 3.免疫组化可见经过萃取的各组切片均有不同程度的脱片现象，全部六组中LN和ColⅠ染色都呈阳性，第二组可见基底膜结构稍欠完整；第一、二组NF和S-100染色均阴性，萃取一次组、萃取12h组、Triton X—200组有阳性表现，萃取一次组阳性尤其明显。 4.MBP电泳见萃取一次组、萃取12h组仍有髓磷脂碱性蛋白残留，其余各萃取组未见明显MBP条带。 5.TEM可见第二组萃取最干净且基底膜保持完整，与其它萃取组有统计学差异；萃取一次组、萃取12h组、Triton X—200组基底膜完整，有髓鞘和细胞碎片存留，尤以萃取一次组存留最多；对照组神经结构正常。 6.凯氏定氮法显示萃取制备的各组人源性去细胞同种异体神经中，第一组为7.1％，第二组为6.5％，萃取一次组为10.9％，萃取12h组为8.4％，Triton X—200组为9.1％，对照组为13.1％。其中第二组中蛋白比例最低，表示其雪旺细胞和轴突成分去除最彻底。 7.不同规格的人源性去细胞周围神经材料经过标准萃取流程处理后，其HE、Hoechst染色、免疫组化包括LN、NF、S-100、ColⅠ染色以及透射电镜观察，其神经形态的完整性和雪旺细胞、轴突去除干净程度未见有明显统计学差异。 8.PBS清洗液与制备萃取好的神经体积比1:300比其比值为1:100更能降低Triton X-100和Deoxycholate的残留浓度，两种体积比之间可见有明显统计学差异。 结论： 1.经过适当的化学萃取处理程序，人源性同种异体周围神经可获得生物物理性状与外科缝合条件下大致可满足临床修复的脱细胞支架材料。 2.此种脱细胞材料在经过适当的处理之后，可保持基底膜结构的完整，已几乎不残留细胞与髓鞘成分。组织内示意蛋白含量的氮含量最大降低量超过50％(13.1-6.5)。本实验对比研究提供了完整的组织学、免疫组织化学、透射电镜和蛋白电泳及氮含量测定的依据。 3.据现有研究资料可以认为上述检测指标可作为确定适当或理想的化学萃取制备工艺流程的质量控制指标，而能达到此质量控制指标的流程可设计为生产可供临床试用产品的企业生产标准，(事实上我们此标准流程已获中国药品生物制品检定所批准为企业送检合格产品之生产标准)。 4.本研究确认的制备人源性同种异体神经去细胞支架材料的标准方法流程为：神经无菌PBS液泡洗2h→3％ Triton X-100振荡24h→PBS冲洗3遍，每遍5min→4％脱氧胆酸钠液振荡24h→PBS冲洗3遍，每遍5min→3％ Triton X-100振荡24h→PBS冲洗3遍，每遍5min→4％脱氧胆酸钠液振荡24h→PBS冲洗3遍，每遍5min→PBS液(含100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素)中0-4℃保存备用. 5.经过标准流程制备的人源性同种异体脱细胞神经材料经过5次PBS清洗液与制备萃取好的神经体积比1:300的清洗能降低萃取剂的残留浓度低于200ppm，从而可以满足临床应用的组织工程化人工神经标准。 6.不同直径人体神经可选用相同的化学萃取程序制备去细胞同种异体神经支架材料，其人体神经大体架构的完整性和细胞、轴突等抗原成分去除之间无统计学差别。故本研究第一部分提出的制备标准工艺流程可适应于所有人源性周围神经材料。