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背景胆囊癌(Gallbladder carcinoma,GBC)是一种胆道系统中常见的最具侵袭性的恶性肿瘤。在中国,胆囊癌在消化系统肿瘤发病率中居第七,约占所有肿瘤病例的1%,发病率达3.82/10万人。因为缺乏特异性的症状、有效的治疗方式和预后指标,胆囊癌的预后不尽如人意。流行病学统计显示胆囊癌的总体生存期约为6个月,5年生存率低于10%。因此,研究胆囊癌的发病机制,有助于为胆囊癌的防治提供理论基础和治疗新策略与手段,具有重要的理论和临床意义。有研究提出胆囊腺瘤-胆囊癌假说阐述胆囊癌的疾病进展,随后形态学和DNA测序研究进一步验证的了这一假说。近期的研究提示胆囊腺瘤-胆囊癌假说较化生-异常增生-胆囊癌假说在韩国年轻胆囊癌患者的肿瘤形成中扮演更为重要的角色。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian rapamycin receptor,mTOR)信号通路和丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase,MEK)信号通道在胆囊癌的发生发展中都起到重要的作用。真核翻译起始因子4F(eukaryotic translation initiation factor 4F,eIF4F)作为翻译起始阶段的关键调控靶点,是mTOR通路和MAPK通路信号传导的共同作用点。真核翻译起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E,eIF4E)是一种帽结合蛋白,可以特异性地识别mRNA的5’端的帽子结构。eIF4E与真核翻译起始因子4A(eukaryotic translation initiation factor 4A,eIF4A)和真核翻译起始因子4G(eukaryotic translation initiation factor 4G,eIF4G)共同组成eIF4F参与真核翻译起始。eIF4E水平的变化在不同程度上影响一系列编码增殖和促进肿瘤形成蛋白的mRNAs翻译。这些mRNAs被统称为eIF4E敏感mRNAs,包括细胞周期蛋白、鸟氨酸脱羧酶、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和磷酸核糖焦磷酸合成酶2等。最近,eIF4E在肿瘤中的作用引起了研究者们的广泛兴趣。在肿瘤组织中,eIF4E的表达水平增加的。如头面部鳞癌,MYC介导转录激活基因扩增导致eIF4E的过表达,肿瘤边缘eIF4E过表达提示复发可能大,并且与生存呈负相关。本研究中,我们检测了eIF4E在非疾病胆囊、胆囊腺瘤和胆囊癌组织中的表达水平,统计分析了三组标本组织中eIF4E的表达差异,统计分析了eIF4E表达水平与胆囊癌患者临床病理资料和预后的相关性,并对eIF4E是否通过细胞周期相关蛋白影响胆囊癌的疾病进展进行了探讨。材料与方法1.本研究经安徽医科大学第一附属医院伦理委员会批准,所有患者均提供书面知情同意书。选取2011年11月至2016年11月在普外科接受根治性胆囊切除术的GBC患者共76例GBC标本。所有纳入研究的患者都没有接受过任何预先治疗。对照组包括21例取自于因肝血管瘤接受肝切除联合胆囊切除术患者的非疾病胆囊组织,另37例因胆囊腺瘤接受腹腔镜胆囊切除术患者的胆囊腺瘤组织。根据美国联合癌症委员会(AJCC)胆囊癌分期标准确定胆囊癌的解剖和组织学分级。2.免疫组化(SABC)法测定每组组织标本eIF4E的表达水平,并以细胞胞浆内有明显黄色或棕黄色颗粒判定为阳性细胞。在Nikon Eclipse 8ic显微镜下,每张切片随机选取5个400倍不连续视野,用Nikon Digital camera摄像并保存待测量图片,Image Pro Plus 6.0图像分析系统测量所得图片中eIF4E染色的光密度(optical density,OD)值,取平均OD值作为测量值。3.细胞实验慢病毒感染胆囊癌细胞,通过细胞增殖实验、集落形成试验观察敲低eIF4E表达水平所导致胆囊癌细胞功能表型的改变,应用流式细胞检测敲低eIF4E所导致胆囊癌细胞周期变化,运用免疫印迹分析(Western blotting,WB)检测敲低eIF4E所导致胆囊癌细胞的细胞周期相关蛋白的变化。4.裸鼠成瘤实验使用NOZ胆囊癌细胞株在BALB/C裸鼠体内建立皮下异种移植模型。将裸鼠随机分成sh-eIF4E-1(敲低eIF4E的序列1)和sh-eIF4E-2(敲低eIF4E的序列1)两组,每组5只。将表达对照shRNA或敲低eIF4E shRNA的5x10~6个NOZ细胞分别注射于4周龄的雄性在BALB/C裸鼠(南京SLAC实验动物有限公司)的背部左右两侧(n=5只/组)。注射后1周,每4天用游标卡尺测量肿瘤,计算公式为:体积=长度×宽度~2×0.52。然后,注射4周后处死裸鼠,切除肿瘤并称重。在测量肿瘤的重量时,实验人员对肿瘤组织的信息不知情。切除肿瘤均质化,提取蛋白进行WB分析收集的异种移植瘤体组织中p27、cyclin D1、cyclin E1的表达水平,IHC检测收集的异种移植瘤体组织中p27、cyclin D1、cyclin E1、Ki-67的表达水平。动物研究经中国科学技术大学动物研究伦理委员会批准(批准号:PXTG-MYD2017102611)。5.统计方法采用SPSS 17.0统计软件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)处理。偏态分布资料以M(P25,P75)表示,多组间采用Kruskal-Wallis H检验分析,两组间采用Mann-Whitney U检验分析。正态资料以?±s表示,采用单因素方差分析。采用Bonferroni事后校正。分类资料采用卡方检验分析。应用Kaplan-Meier法计算累积生存率,生存率差异比较采用Log-rank检验。应用Cox回归进行单因素及多因素分析。以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.eIF4E在非疾病胆囊组、胆囊腺瘤组和胆囊癌组中的表达水平呈进行性增高GBC中eIF4E表达明显高于胆囊腺瘤,正常胆囊组织中eIF4E表达明显低于胆囊腺瘤,三组间比较和各两组间比较的差异均有统计学意义(P<0.05)。2.eIF4E表达水平随胆囊癌的进展逐渐增高,并与胆囊癌患者的总生存期相关eIF4E蛋白在T2-T4期胆囊癌原发灶中的表达水平明显高于Tis-T1期,两组间差异有统计学意义(P<0.05);在进展期胆囊癌亚组(TNMⅡ-ⅢB期)中表达水平明显高于早期胆囊癌亚组(TNM 0-Ⅰ期),两组间差异有统计学意义(P<0.05)。另外,eIF4E在G3-G4(差-未分化)亚组的表达水平高于G1-G2(高-中分化)亚组,两者差异有统计学差异(P<0.05)。生存分析显示,胆囊癌eIF4E高表达亚组(OD≥0.3955)的术后总体生存期(overall survival,OS)低于低表达亚组,两者差异有统计学意义(P<0.05),eIF4E高表达亚组的术后中位生存期为5个月,而eIF4E低表达亚组的术后中位生存期为18个月;进展期(TNMⅡ-ⅢB)胆囊癌亚组的术后生存期明显短于早期(TNM 0-Ⅰ期)胆囊癌亚组,差异有统计学差异(P<0.05)。多因素分析显示eIF4E表达水平、TNM分期和组织学分级是影响胆囊癌患者预后的独立因素(P<0.05)。3.敲低eIF4E可抑制GBC-SD和NOZ胆囊癌细胞株在体外的增殖和集落形成细胞生长曲线显示eIF4E表达水平的下调显著抑制了GBC-SD和NOZ胆囊癌细胞的增殖,差异有统计学意义(P<0.05)。与细胞生长曲线的观察结果一致,感染含特异性敲低eIF4E shRNA慢病毒(sh-eIF4E组)的GBC-SD和NOZ胆囊癌细胞株的集落形成能力明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);在软琼脂中,与sh-control组(对照组)相比,sh-eIF4E组集落数量明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。慢病毒感染96h后,sh-eIF4E组G0/G1期细胞比例较对照组的GBC-SD和NOZ胆囊癌细胞都有明显的升高,差异有统计学意义(P<0.05);而且sh-eIF4E组中NOZ细胞的G2/M期细胞比例下降,差异有统计学意义(P<0.05)。进一步采用WB检测显示:与对照组相比,sh-eIF4E组中GBC-SD和NOZ胆囊癌细胞株的细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E1的表达水平下降,差异有统计学意义(P<0.05)。同时,sh-eIF4E组中GBC-SD和NOZ胆囊癌细胞株的p27表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。4.敲低eIF4E可在体内抑制了NOZ胆囊癌细胞株异种移植肿瘤的生长为了进一步探索eIF4E在GBC疾病进展中的作用,本研究使用NOZ胆囊癌细胞株在BALB/C裸鼠体内建立了皮下异种移植模型。sh-eIF4E组与sh-control组相比,肿瘤的生长受到明显抑制,异种移植体内肿瘤的体积和重量均有所下降。进一步采用WB检测收集的异种移植瘤体组织中p27、cyclin D1、cyclin E1的表达水平,采用IHC检测p27、cyclin D1、cyclin E1、Ki-67的表达水平。与对照组相比,sh-eIF4E组中异种移植瘤体组织cyclin D1、cyclin E1和Ki-67表达水平降低,而p27表达水平升高。结论eIF4E是一种潜在的胆囊癌预后的独立危险因素,通过细胞周期相关蛋白影响胆囊癌细胞的增殖,可能在胆囊癌的疾病进展中发挥重要作用。本研究为探索胆囊癌的发病机理提供了新见解,为胆囊癌的治疗提供了新的思路。