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糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是终末期肾病的主要原因,通常认为年龄、病程、血压、肥胖、血脂、尿酸、环境污染物等是DN主要危险因素。DN发病机制复杂,目前尚未明确,其发病与肾脏血流动力学变化、炎症反应、氧化应激、内环境代谢紊乱、晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)积聚和细胞自噬改变等多种因素有关。2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)患者睡眠问题明显高于非T2DM患者,更容易发生睡眠障碍(Sleep Disorder,SD)。SD与胰岛素抵抗、糖耐量异常、胰岛素第一相分泌异常等有关。褪黑素(Melatonin,MLT)是调节昼夜节律最重要的内分泌激素。MLT作为一种抗氧化剂,通过直接解毒活性氧和活性氮,间接刺激抗氧化酶,抑制促氧化剂酶活性等多种方式降低氧化应激。MLT具有一定调节糖脂代谢和改善胰岛功能,改善胰岛素敏感性的作用。有研究认为,MLT减轻链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的DN大鼠肾损害。胰高血糖素样肽-1受体激动剂(Glucagon-like peptide-1 Receptor Agonist,GLP-1RA),近年来广泛用于DM临床治疗。在调控血糖的同时,GLP-1RA通过改善肾脏血流动力、炎症反应、氧化应激,激活自噬等改善肾脏结构和功能。目前,GLP-1RA与MLT肾脏保护作用机制和GLP-1RA与MLT之间相互影响和作用尚不明确。本研究旨在通过观察MLT和GLP-1RA对糖脂代谢和肾脏病变影响,探讨其对DM肾脏病变的保护机制。为DM肾脏病变的防治提供一定理论依据和策略。第一部分褪黑素对糖尿病大鼠TGF-β-Smad与Wnt/β-catenin信号通路和肾脏病变影响目的:通过MLT对超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶活性(glutathione peroxidase,GSH-Px)及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平以及TGF-β-Smad2/3信号通路和Wnt/β-catenin信号通路的影响研究,探讨MLT对DM大鼠肾脏保护作用和可能机制。方法:1.本研究选取50只SPF级雄性SD大鼠,符合正常血糖标准的48只大鼠入组,随机选取8只做为NC组,40只大鼠给予高糖高脂饲料联合STZ诱导制备DM模型。2.造模成功的38只大鼠随机分为糖尿病组(DM组,8只),低剂量褪黑素治疗组(MLT-L组,10只),中剂量褪黑素治疗组(MLT-M组,10只),高剂量褪黑素治疗组(MLT-H组,10只)。MLT组给予不同剂量MLT灌胃,其中MLT-L组5mg/kg,MLT-M组15mg/kg,MLT-H组MLT30mg/kg,共4周。NC组和DM组给予相同容积生理盐水灌胃。3.观察治疗前后大鼠肾脏病理学改变。4.全自动生化仪检测大鼠FBG、TG、TC、HDL-C、LDL-C、INS、BUN、SCR等生化指标;比色法检测试剂盒检测大鼠肾组织SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA水平;Westernblot法检测大鼠Wnt4、β-catenin、p-EGFR、EGFR、TGFβ1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3水平。结果:1.DM模型制备成功,DM组FBG水平较NC组明显升高(P<0.01)。2.MLT治疗2周后,MLT-M组、MLT-H组FBG水平较DM组下降(P<0.05,P<0.01),MLT-L组FBG水平与DM组间差值,无统计学差异(P>0.05);MLT-L组、MLT-M组和MLT-H组之间FBG水平两两比较,差异显著(P<0.05,P<0.01),MLT-H组0.05)。MLT-L组、MLT-M组和MLT-H组之间FBG水平两两比较,差异显著(P<0.05,P<0.01),MLT-H组0.05)。MLT治疗4周后,MLT-L组、MLT-M组、MLT-H组TC水平较DM组降低(P<0.05,P<0.01);MLT-M组、MLT-H组TG水平较DM组降低(P<0.05,P<0.01);MLT-L组TG水平与DM组间差值,无统计学差异(P>0.05);MLT-H组LDL-C水平较DM组降低(P<0.05),MLT-L组、MLT-M组LDL-C水平与DM组间差值,无统计学差异(P>0.05);MLT-L组、MLT-M组、MLT-H组HDL-C水平与DM组间的差值,无统计学差异(P>0.05)。MLT-H组TC水平较MLT-M组和MLT-L组降低(P<0.05,P<0.01);MLT-M组TC水平与MLT-L组间差值,无统计学差异(P>0.05)。MLT-L组、MLT-M组和MLT-H组间TG水平差两两比较,差异显著(P<0.05,P<0.01),MLT-H组0.05)。MLT-H组LDL-C水平较MLT-L组降低(P<0.05),MLT-H组LDL-C水平与MLT-M组间差值,无统计学差异(P>0.05),MLT-M组LDL-C水平与MLT-L组间差值,无统计学差异(P>0.05)。5.4周末,DM组、MLT-L组、MLT-M组、MLT-H组INS水平较NC组升高(P<0.01);DM组、MLT-L组、MLT-M组、MLT-H组ISI水平较NC组降低(P<0.01)。MLT治疗4周后,MLT-M组、MLT-H组INS水平较DM组下降(P<0.01);MLT-M组和MLT-H组ISI水平较DM组升高(P<0.01)。MLT-L组INS水平与DM组间差值,无统计学差异(P>0.05)。MLT-L组ISI水平与DM组间差值,无统计学差异(P>0.05)。MLT-L组、MLT-M组、MLT-H组间两两比较INS水平差及ISI水平差,差异显著(P<0.05,P<0.01)。INS水平,MLT-H组0.05)。BUN、SCR、UMA、CCR水平,MLT-L组、MLT-M组、MLT-H组间两两比较,差异显著(P<0.05),MLT-H组0.05)。MLT治疗4周后,MLT-L组、MLT-M组、MLT-H组CAT、GSH-Px较DM组升高(P<0.05,P<0.01);MLT-M组、MLT-H组SOD水平较DM组升高(P<0.05,P<0.01);MLT-L组SOD水平与DM组间差值,无统计学差异(P>0.05)。MLT-L组、MLT-M组、MLT-H组MDA较DM组降低(P<0.05,P<0.01)。SOD、CAT、GSH-Px水平MLT-L组、MLT-M组、MLT-H组间两两比较,差异显著(P<0.05,P<0.01),MLT-L组0.05)。8.4周末,DM组、MLT-L组、MLT-M组、MLT-H组EGFR、Smad2、Smad3水平与NC组间差值,无统计学差异(P>0.05)。DM组、MLT-L组、MLT-M组、MLT-H组Wnt4、β-catenin、TGF-β1、P-EGFR、P-Smad2、P-Smad3水平较NC组升高(P<0.05,P<0.01)。MLT治疗4周后,MLT-L组、MLT-M组、MLT-H组β-catenin水平较DM组下降(P<0.01);MLT-M组、MLT-H组Wnt4水平较DM组降低(P<0.01);MLT-L组Wnt4水平与DM组间差值,无统计学差异(P>0.05)。Wnt4、β-catenin水平,MLT-L组、MLT-M组、MLT-H组间两两比较,差异显著(P<0.05),MLT-H组0.05),MLT-M组P-EGFR水平较MLT-L组降低(P<0.01)。MLT-H组TGF-β1水平较MLT-L组下降(P<0.01),MLT-H组TGF-β1水平与MLT-M组间差值,无统计学差异(P>0.05),MLT-M组TGF-β1水平较MLT-L组下降(P<0.01)。MLT-H组P-Smad2和P-Smad3水平较MLT-L组降低(P<0.01);MLT-M组P-Smad2和P-Smad3水平较MLT-L组降低(P<0.01);MLT-H组P-Smad2水平与MLT-M组间差值,无统计学差异(P>0.05);MLT-H组P-Smad3水平与MLT-M组间差值,无统计学差异(P>0.05)。小结:1.STZ诱导的DM大鼠肾组织处于过氧化应激状态;2.MLT改善DM大鼠肾组织氧化应激状态、胰岛素敏感性和胰岛素抵抗;3.MLT改善胰岛素敏感性、肾功能和肾脏氧化应激与TGF-β1-Smad2/3信号通路和Wnt/β-catenin信号通路有关,与MLT剂量有关。第二部分利拉鲁肽对糖尿病大鼠糖脂代谢与NLRP3炎症小体和肾脏病变影响研究目的:探讨利拉鲁肽对DM大鼠糖脂代谢与肾脏功能影响和NLRP3炎症小体的作用机制。方法:1.本研究共纳入40只SPF级雄性SD大鼠,符合正常血糖标准的39只大鼠入组,随机选取8只做为NC组。31只大鼠给予高糖高脂饲料联合STZ诱导制备DM模型。2.造模成功的30只大鼠随机分为糖尿病组(DM组,10只),低剂量利拉鲁肽治疗组(Lira-L组,10只),高剂量利拉鲁肽治疗组(Lira-H组,10只)。利拉鲁肽治疗组给予不同剂量利拉鲁肽皮下注射(Lira-L组125μg/Kg/d,Lira-H组200μg/kg/d),共8周。NC组和DM组给予相同容积生理盐水皮下注射。3.全自动生化仪检测治疗前后各组大鼠FBG、TG、TC、HDL-C、LDL-C、INS水平;24h UMA水平;酶联免疫吸附法检测治疗前后各组大鼠肝脏和肌肉组织糖原含量;Western blot法检测各组大鼠肾组织NLRP 3和凋亡相关斑点样蛋白ASC水平。4.观察治疗前后各组大鼠肾脏病理学改变。结果:1.DM模型制备成功,DM组FBG水平较NC组明显升高,有统计学差异(P<0.01)。2.利拉鲁肽治疗组肾脏病变明显减轻,肾小球基底膜增厚程度明显改善,肾小球系膜基质增生程度明显减轻,按照病变严重程度由轻到重排序,分别是NC组0.05)。第4周、第8周末,Lira-H组FBG水平较Lira-L下降(P<0.01)。4.第8周末,DM组、Lira-L组、Lira-H组空腹INS水平较NC组显著增高(P<0.01)。DM组、Lira-L组、Lira-H组ISI水平较NC组显著降低(P<0.01)。利拉鲁肽治疗8周后,Lira-L组、Lira-H组空腹INS水平较DM组降低(P<0.01),Lira-H组空腹INS水平较Lira-L组下降(P<0.01)。Lira-L组、Lira-H组ISI水平较DM组升高,Lira-H组ISI水平较Lira-L组升高,(P<0.01)。5.第8周末,DM组、Lira-L组、Lira-H组TC、TG、LDL-C水平较NC组显著增高(P<0.05,P<0.01)。DM组、Lira-L组、Lira-H组HDL-C水平与NC组间差值,无统计学差异(P>0.05)。利拉鲁肽治疗8周后,Lira-H组TC水平较DM下降(P<0.01);Lira-L组TC水与较DM组间差值,无统计学差异(P>0.05);Lira-H组TC水平较Lira-L组下降(P<0.01)。Lira-L组、Lira-H组TG水平较DM组下降(P<0.05,P<0.01);Lira-H组TG水平较Lira-L组下降(P<0.01)。Lira-L组、Lira-H组LDL-C水平与DM组间差值,无统计学差异(P>0.05);Lira-H组LDL-C水平与Lira-L组间差值,无统计学差异(P>0.05)。Lira-L组、Lira-H组HDL-C水平与DM组间差值,无统计学差异(P>0.05)。Lira-H组HDL-C水平与Lira-L组间差值,无统计学差异(P>0.05)。6.第8周末,DM组、Lira-L组、Lira-H组UMA水平较NC组明显升高(P<0.01)。利拉鲁肽治疗8周后,Lira-L组、Lira-H组UMA水平较DM组明显下降(P<0.01);Lira-H组UMA水平较Lira-L组明显下降(P<0.01)。7.第8周末,DM组、Lira-L组、Lira-H组BUN、SCR水平较NC组明显升高(P<0.05,P<0.01)。利拉鲁肽治疗8周后,Lira-L组、Lira-H组BUN、SCR水平较DM组明显下降(P<0.05,P<0.01)。Lira-H组BUN、SCR水平较Lira-L组下降(P<0.05,P<0.01)。8.第8周末,DM组、Lira-L组、Lira-H组肝糖原水平较NC组降低(P<0.01),DM组、Lira-L组、Lira-H组大鼠肌糖原水平较NC组升高(P<0.01)。利拉鲁肽治疗8周后,Lira-L组、Lira-H组肝糖原水平较DM组升高(P<0.01)。Lira-H组肝糖原水平较Lira-L组升高(P<0.01)。Lira-L组、Lira-H组肌糖原水平较DM组降低(P<0.01)。Lira-H组肌糖原水平与Lira-L组间差值,无统计学差异(P>0.05)。9.第8周末,DM组、Lira-L组、Lira-H组肾脏组织NLRP3和ASC水平较NC组明显升高(P<0.05,P<0.01)。利拉鲁肽治疗8周后,Lira-L组和Lira-H组肾脏组织NLRP3和ASC水平较DM组降低(P<0.01)。Lira-H组肾脏组织NLRP3和ASC水平较Lira-L组降低(P<0.05,P<0.01)。小结:1.GLP-1RA降低DM动物模型TC、TG水平和肾组织NLRP 3、ASC蛋白水平,这些作用与DM动物模型肾功能改善有关;2.GLP-1RA治疗组FBG和胰岛素抵抗状态改善与抑制肝糖原输出和增加肌糖原利用有关。第三部分短期利拉鲁肽治疗对早期2型糖尿病肾病睡眠障碍患者血清褪黑素分泌影响与肾脏保护作用目的:探讨短时间利拉鲁肽治疗对伴有睡眠障碍早期DN患者血清褪黑素分泌影响与可能的肾脏保护作用。方法:1.入选符合入组标准的伴有睡眠障碍早期DN患者134名,随机分为对照组(DN组)和治疗组(T组)。2.DN组,维持原有基础治疗方案,根据血糖监测结果,正负双向调整降糖药物剂量,不增加降糖药物及其他药物种类。T组,在原有基础治疗方案基础上,给予利拉鲁肽每日1次皮下注射。第1周0.6mg/d,第2周1.2mg/d,第3周1.8mg/d,此后维持1.8mg/d,共6个月;根据血糖监测结果,在血糖达标、低血糖或出现低血糖样症状时,对基础降糖药物进行负向调整;不增加降糖药物及其他药物种类。(所有患者的基础治疗方案中,口服降糖药物包括二甲双胍、阿卡波糖、瑞格列奈;胰岛素制剂包括甘精胰岛素注射液、赖脯胰岛素注射液、门冬胰岛素注射液、门冬胰岛素30注射液。)3.收集患者一般资料:年龄、性别、病程、身高、体重,计算体质指数等。4.完成PSQI量表,评价患者治疗前后PSQI评分、睡眠时长、睡眠质量评分等。5.检测患者FPG、Hb A1c、FC-P、FINS、TG、TC、LDL-C、HDL-C、MLT、Cys C、HIF-1α、VEGF、UACR、L-FABP;计算HOMA-IR。结果:1.两组患者一般情况和主要检测指标基线情况一致,具有可比性(P>0.05)。2.两组患者基础治疗方案总体构成比无差异,具有可比性(P>0.05)。3.两组患者基础治疗方案中,各药物日均剂量无差异,具有可比性(P>0.05)。4.利拉鲁肽治疗6月后,T组PSQI较DN组降低(P<0.01),T组睡眠时长、MLT水平较DN组升高(P<0.05,P<0.01),T组睡眠质量评分较DN组降低(P<0.01)。DN组PSQI水平治疗后较治疗前降低(P<0.01),睡眠质量评分治疗后较治疗前降低(P<0.01),睡眠时长治疗后与治疗前的变化,无统计学差异(P>0.05),MLT水平治疗后与治疗前的变化,无统计学差异(P>0.05)。T组PSQI水平治疗后较治疗前降低(P<0.01),睡眠时长和MLT水平治疗后较治疗前增加(P<0.01),睡眠质量评分治疗后较治疗前降低(P<0.01)。5.利拉鲁肽治疗6月后,T组FBG、Hb A1c、HOMA-IR较DN组降低(P<0.05),FINS和FC-P较DN组升高(P<0.05)。DN组FBG、Hb A1c水平治疗后较治疗前降低(P<0.05,P<0.01),FC-P水平治疗后与治疗的变化,无统计学差异(P>0.05),FINS水平治疗后与治疗前的变化,无统计学差异(P>0.05),HOMA-IR水平治疗后与治疗前的变化,无统计学差异(P>0.05)。T组FBG、Hb A1c、HOMA-IR水平治疗后较治疗前降低(P<0.05,P<0.01),FINS、FC-P水平治疗后较治疗增加(P<0.05,P<0.01)。6.利拉鲁肽治疗6月后,T组TC、TG、LDL-C水平较DN组降低(P<0.05,P<0.01),T组HDL-C水平与DN组间差值,无统计学差异(P>0.05)。DN组TC、LDL-C、HDL-C水平治疗后与治疗前的变化,无统计学差异(P>0.05);TG水平治疗后较治疗前降低(P<0.05)。T组TC、TG、LDL-C水平治疗后较治疗前降低(P<0.05,P<0.01);T组HDL-C水平治疗后与治疗前的变化,无统计学差异(P>0.05)。7.利拉鲁肽治疗6月后,T组血清Cys C、HIF-1α、VEGF水平较DN组降低(P<0.01)。DN组血清Cys C、HIF-1α、VEGF水平治疗后较治疗前减低(P<0.01)。T组血清Cys C、HIF-1α、VEGF水平治疗后较治疗前减低(P<0.01)。8.利拉鲁肽治疗6月后,T组尿液UACR、L-FABP水平较DN组降低(P<0.01)。DN组尿液UACR、L-FABP水平治疗后较治疗前降低(P<0.05,P<0.01)。T组尿液UACR、L-FABP水平治疗后较治疗前降低(P<0.01)。小结:1.短期利拉鲁肽治疗后,早期DN患者睡眠质量得到一定程度改善;2.短期利拉鲁肽治疗后,早期DN患者MLT水平有一定程度提高;MLT水平增高,可能对改善睡眠质量、提高胰岛功能、改善胰岛素抵抗有益;3.短期利拉鲁肽治疗,对DN患者有肾脏获益。结论:1.MLT可改善肾组织氧化应激状态,改善肾脏功能,该作用与TGF-β1-Smad2/3信号通路和Wnt/β-catenin信号通路有关,与MLT剂量有关。2.GLP-1RA具有肾脏保护作用,这一作用与GLP-1RA调节糖脂代谢以及抑制NLRP 3炎症小体,减少ASC蛋白水平有关。3.GLP-1RA可通过抑制肝糖原输出和增加肌糖原利用,改善胰岛素抵抗状态,增加胰岛素敏感性。4.短期利拉鲁肽治疗后,伴有睡眠障碍的早期DN患者睡眠质量得到一定程度改善,同时血清MLT水平增加。MLT水平增高,可能对改善睡眠质量、延长睡眠时间、提高胰岛功能、改善胰岛素抵抗有益。