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研究背景
骨癌痛是最常见的慢性疼痛类型之一。由于骨组织的微环境适合肿瘤细胞的迁移及生长，研究发现约2/3恶性肿瘤患者晚期发生骨转移，继而出现严重的骨癌痛。骨癌痛常表现为自发性疼痛、痛觉过敏、触诱发痛等特征。目前非甾体类消炎药和阿片类镇痛药等用于骨癌痛的临床治疗，具有一定的疗效，但是由于便秘、恶心、呕吐、过度镇静、呼吸抑制和成瘾等副作用，其应用具有局限性。因此，成功建立合适的骨癌痛动物模型以研究其发生和发展机制，寻找骨癌痛新的治疗方法，是目前亟需解决的重要问题。
自噬(autophagy)又称为II型程序性细胞死亡，是细胞依赖溶酶体将自身代谢废物进行降解并加以循环利用的过程。当细胞内的蛋白质或细胞器受损，通过自噬被降解成小分子物质，为能量代谢提供底物，维持细胞内环境稳定。大量研究证实自噬失调与肿瘤生成、免疫性疾病、心血管疾病及神经退行性病变等密切相关。近年来，越来越多的证据发现细胞自噬在肿瘤对抗放化疗以及靶向治疗的过程中起重要的作用。有研究表明自噬功能障碍参与神经病理性疼痛的发生和发展，自噬激动剂雷帕霉素能显著缓解神经损伤导致的机械性痛觉异常和热痛觉过敏。但是，自噬是否参与CIBP发生发展及其具体机制尚未有报道。
炎症小体(inflammasomes)作为细胞内的一种大分子蛋白质复合体，与炎症反应的发生和发展过程紧密相连，在免疫系统中发挥重要的作用。在应激状态或免疫细胞被感染时，炎症小体被过度激活引起失控的炎症级联反应，导致组织损伤或者肿瘤生成。大量研究表明，炎症小体与许多疾病的发生及发展密切相关，如关节炎、代谢性疾病、变态反应和胃癌等。NLRP3炎症小体是现阶段研究中最为热门的亚型，主要表达于单核巨噬细胞、淋巴细胞和小胶质细胞等。研究证实，活性氧自由基释放过多、组织损伤和缺血等因素在激活NLRP3炎症小体的同时细胞自噬也可被激活。鉴于自噬能够通过不同机制调节NLRP3炎症小体的状态和功能，我们假设NLRP3炎症小体信号通路可能是自噬调节CIBP的机制之一。
因此，本研究拟通过建立大鼠CIBP模型，观察骨癌痛大鼠脊髓自噬相关蛋白和NLRP3炎症小体的表达变化情况。检测自噬激动剂和NLRP3特异性抑制剂对CIBP发生及发展的影响，探讨自噬在CIBP中的作用及相关机制。
研究方法和结果
第一部分自噬激活参与骨癌痛发生
方法：
实验一：选择成年雌性SD大鼠，体重为180-200g，随机分为三组：
正常对照组(na?ve组)：不做任何处理；
假手术组(sham组)：大鼠右胫骨上段骨腔内注射无菌PBS液10μl；
骨癌痛组(CIBP组)：大鼠右胫骨上段骨腔内注射大鼠Walker256乳腺癌细胞悬浊液10μl(约4x107个)，建立大鼠骨癌痛模型。
各组大鼠分别在造模前和造模后3、7、14和21d使用VonFrey丝检测右侧足底的机械性缩爪阈值(Mechanical paw withdrawal threshold, MPWT)。运用Westernblot和免疫荧光染色方法检测大鼠脊髓自噬相关蛋白Beclin-1、LC-3II和P62的蛋白表达及细胞分布情况。
实验二：建立大鼠CIBP模型，随机分为四组：sham+vehicle组，CIBP+vehicle组,CIBP+Rap组和CIBP+3-MA+Rap组。CIBP+Rap组在造模后14d腹腔给予自噬激动剂Rap(Rapamycin，雷帕霉素，1，5，10mg/kg)，观察单次腹腔给予Rap对CIBP大鼠疼痛行为学的作用；在14-18d连续腹腔给予Rap，观察Rap连续腹腔注射对CIBP大鼠MPWT的作用。CIBP+3-MA+Rap组14d在注射Rap前0.5h先腹腔给予自噬抑制剂3-MA(3-Methyladenine，3-甲基腺嘌呤，20mg/kg)，观察自噬抑制剂3-MA对自噬激动剂Rap减轻骨癌痛作用的影响。利用Westernblot和免疫荧光方法检测自噬激动剂及自噬抑制剂对大鼠脊髓自噬相关蛋白Beclin-1、LC-3II和P62的表达水平及细胞分布情况的影响。
结果：
na?ve组和sham组大鼠的MPWT未见明显改变，但CIBP组大鼠的MPWT在模型建立后7d明显降低，并且持续至造模后21d。造模后14d单次腹腔给予Rap1mg/kg对CIBP大鼠的MPWT没有明显影响，但是按5mg/kg和10mg/kg剂量单次给予Rap能够明显提高CIBP大鼠的MPWT，且表现为剂量依赖性。5mg/kg组在药物注射后2h开始起效并达峰值，4h失效；10mg/kg组在注射后1h开始起效，2h达峰，6h药效消失。14-18d按5mg/kg和10mg/kg剂量连续腹腔给予Rap明显提高CIBP大鼠的MPWT。提前腹腔注射自噬抑制剂3-MA明显逆转了Rap对CIBP组大鼠的疼痛缓解效果。Westernblot和免疫荧光染色结果显示，CIBP大鼠脊髓的自噬相关蛋白Beclin-1、LC-3II和P62蛋白表达量明显增加；14-18d连续腹腔注射Rap进一步上调CIBP大鼠脊髓Beclin-1和LC-3II的蛋白表达，而P62的蛋白表达被显著抑制；且该效果被提前腹腔注射自噬抑制剂3-MA所逆转。Beclin-1、LC-3II和P62只分布于脊髓神经元，不与星形胶质细胞和小胶质细胞共表达。
第二部分抑制NLRP3炎症小体信号通路缓解骨癌痛
方法：
实验一：选择成年雌性SD大鼠，随机分为正常对照组、假手术组和骨癌痛组，建立大鼠骨癌痛模型过程同第一部分。分别在建模前和建模后3、7、14和21d检测大鼠右侧足底的MPWT，采用Westernblot和免疫荧光方法检测大鼠脊髓NLRP3炎症小体重要组成成分NLRP3、ASC和Caspase-1及其下游效应分子IL-1β的蛋白表达及细胞分布变化情况。
实验二：建立大鼠CIBP模型，随机分为四组：sham+vehicle组，sham+MCC950组，CIBP+vehicle组和CIBP+MCC950组。14d腹腔给予NLRP3特异性抑制剂MCC950(1，5，10mg/kg)，观察单次给予NLRP3特异性抑制剂对CIBP大鼠疼痛行为学的作用。在14-18d连续腹腔给予MCC950，观察多次注射NLRP3特异性抑制剂对CIBP大鼠MPWT的作用。利用Westernblot和免疫荧光染色方法检测大鼠脊髓NLRP3炎症小体重要组成成分NLRP3、ASC和Caspase-1及其下游效应分子IL-1β的蛋白表达及细胞分布变化情况。
结果：
行为学结果显示，在建模后14d单次注射MCC9501mg/kg没有明显改变CIBP大鼠的MPWT，但腹腔给予MCC9505mg/kg和10mg/kg能够明显提高CIBP大鼠的MPWT，且表现为剂量依赖性。5mg/kg组给药后1h开始起效，2h达高峰，6h药效消失；10mg/kg组给药后0.25h开始上升，2h达高峰，12h药效消失。而且，在14-18d连续腹腔给予MCC950明显提高CIBP大鼠的MPWT。Westernblot和免疫荧光染色结果显示，NLRP3炎症小体重要组成成分NLRP3、ASC和Caspase-1及其下游效应分子IL-1β在CIBP大鼠脊髓的蛋白表达明显增加，但连续腹腔给予MCC950下调其蛋白表达。其中NLRP3和IL-1β主要分布于脊髓神经元细胞中，极少数分布于小胶质细胞和星形胶质细胞；ASC仅分布于脊髓神经元，不与小胶质细胞及星形胶质细胞共表达；Caspase-1主要分布于脊髓神经元细胞，极少数分布于星形胶质细胞，不与小胶质细胞共表达。
第三部分自噬调控NLRP3炎症小体信号通路缓解骨癌痛
方法：
选择雌性SD大鼠，建立CIBP模型方法同第一部分，随机分为四组：sham+vehicle组，CIBP+vehicle组,CIBP+Rap组和CIBP+3-MA+Rap组。CIBP+Rap组在造模后14-18d连续腹腔给予自噬激动剂Rap10mg/kg,CIBP+3-MA+Rap组14-18d腹腔给予Rap10mg/kg治疗前0.5h先腹腔给予自噬抑制剂3-MA20mg/kg。取大鼠脊髓组织，利用Westernblot和免疫荧光染色方法检测NLRP3炎症小体重要组成成分NLRP3、ASC和Caspase-1及其下游效应分子IL-1β在大鼠脊髓的表达变化情况。
结果：
免疫荧光和Westernblot结果显示，与sham+vehicle组相比，NLRP3炎症小体重要组成成分NLRP3、ASC和Caspase-1及其下游效应分子IL-1β在CIBP+vehicle组的大鼠脊髓中的蛋白表达明显增加；在CIBP+Rap组，连续腹腔给予Rap显著下调其蛋白表达；但在CIBP+3-MA+Rap组，该效果被提前给予自噬抑制剂3-MA所阻断，上述分子的蛋白表达明显增加。
统计学分析
所有实验数据统计学分析均使用GraphPadPrism5软件，计量资料统一采用均数±标准误表示。行为学结果使用双因素方差(two-way ANOWA)分析，Westernblot结果使用单因素方差(one-way ANOVA)分析。p＜0.05认为差异具有统计学意义。
研究总结
1.主要研究结果
1.1.CIBP大鼠脊髓自噬相关蛋白Beclin-1和LC-3II表达增加，表明自噬被激活。腹腔给予自噬激动剂Rap显著上调自噬相关分子的蛋白表达水平，且明显缓解CIBP大鼠的疼痛行为学；但Rap改善骨癌痛症状的效果被提前腹腔给予自噬抑制剂3-MA所逆转。
1.2.CIBP大鼠脊髓NLRP3炎症小体信号通路激活，其重要组成成分NLRP3、ASC和Caspase-1及其下游效应分子IL-1β的蛋白表达水平显著上调。腹腔给予NLRP3特异性抑制剂MCC950明显缓解CIBP大鼠的MPWT，且呈剂量依赖性。连续腹腔给予MCC950显著下调NLRP3、ASC和Caspase-1及其下游效应分子IL-1β的蛋白表达水平。
1.3.连续腹腔给予自噬激动剂Rap显著抑制NLRP3炎症小体重要组成成分NLRP3、ASC和Caspase-1及其下游效应分子IL-1β的蛋白表达水平，但该作用被提前腹腔给予自噬抑制剂3-MA所逆转。
2.研究结论
2.1.CIBP大鼠脊髓自噬被激活，且自噬激动剂Rap能明显减轻骨癌痛。
2.2.NLRP3炎症小体信号通路介导骨癌痛的发生和发展。
2.3.抑制NLRP3炎症小体信号通路是自噬激动剂缓解骨癌痛的重要机制之一。
3.创新之处
3.1.证实了自噬在CIBP发生和发展中的作用。
3.2.揭示了NLRP3炎症小体信号通路参与CIBP的发生和发展。
3.3.揭示了自噬激活通过调控NLRP3炎症小体信号通路缓解骨癌痛的具体机制。
4.展望
4.1.本研究揭示了自噬激动剂Rap显著缓解骨癌痛大鼠机械性痛觉异常，但自噬是维持细胞内环境稳定的重要机制之一，其过度激活是否会加重细胞失衡使骨癌痛加剧有待进一步验证。
4.2.该研究发现自噬可调控NLRP3炎症小体信号通路，然而NLRP3炎症小体信号通路是否能反向调控自噬，仍需要进一步探究。
4.3.由于自噬的生物学功能十分复杂，NLRP3炎症小体信号通路是否是其作用的唯一通路尚未确定，自噬参与骨癌痛的其他机制有待进一步探讨。
骨癌痛是最常见的慢性疼痛类型之一。由于骨组织的微环境适合肿瘤细胞的迁移及生长，研究发现约2/3恶性肿瘤患者晚期发生骨转移，继而出现严重的骨癌痛。骨癌痛常表现为自发性疼痛、痛觉过敏、触诱发痛等特征。目前非甾体类消炎药和阿片类镇痛药等用于骨癌痛的临床治疗，具有一定的疗效，但是由于便秘、恶心、呕吐、过度镇静、呼吸抑制和成瘾等副作用，其应用具有局限性。因此，成功建立合适的骨癌痛动物模型以研究其发生和发展机制，寻找骨癌痛新的治疗方法，是目前亟需解决的重要问题。
自噬(autophagy)又称为II型程序性细胞死亡，是细胞依赖溶酶体将自身代谢废物进行降解并加以循环利用的过程。当细胞内的蛋白质或细胞器受损，通过自噬被降解成小分子物质，为能量代谢提供底物，维持细胞内环境稳定。大量研究证实自噬失调与肿瘤生成、免疫性疾病、心血管疾病及神经退行性病变等密切相关。近年来，越来越多的证据发现细胞自噬在肿瘤对抗放化疗以及靶向治疗的过程中起重要的作用。有研究表明自噬功能障碍参与神经病理性疼痛的发生和发展，自噬激动剂雷帕霉素能显著缓解神经损伤导致的机械性痛觉异常和热痛觉过敏。但是，自噬是否参与CIBP发生发展及其具体机制尚未有报道。
炎症小体(inflammasomes)作为细胞内的一种大分子蛋白质复合体，与炎症反应的发生和发展过程紧密相连，在免疫系统中发挥重要的作用。在应激状态或免疫细胞被感染时，炎症小体被过度激活引起失控的炎症级联反应，导致组织损伤或者肿瘤生成。大量研究表明，炎症小体与许多疾病的发生及发展密切相关，如关节炎、代谢性疾病、变态反应和胃癌等。NLRP3炎症小体是现阶段研究中最为热门的亚型，主要表达于单核巨噬细胞、淋巴细胞和小胶质细胞等。研究证实，活性氧自由基释放过多、组织损伤和缺血等因素在激活NLRP3炎症小体的同时细胞自噬也可被激活。鉴于自噬能够通过不同机制调节NLRP3炎症小体的状态和功能，我们假设NLRP3炎症小体信号通路可能是自噬调节CIBP的机制之一。
因此，本研究拟通过建立大鼠CIBP模型，观察骨癌痛大鼠脊髓自噬相关蛋白和NLRP3炎症小体的表达变化情况。检测自噬激动剂和NLRP3特异性抑制剂对CIBP发生及发展的影响，探讨自噬在CIBP中的作用及相关机制。
研究方法和结果
第一部分自噬激活参与骨癌痛发生
方法：
实验一：选择成年雌性SD大鼠，体重为180-200g，随机分为三组：
正常对照组(na?ve组)：不做任何处理；
假手术组(sham组)：大鼠右胫骨上段骨腔内注射无菌PBS液10μl；
骨癌痛组(CIBP组)：大鼠右胫骨上段骨腔内注射大鼠Walker256乳腺癌细胞悬浊液10μl(约4x107个)，建立大鼠骨癌痛模型。
各组大鼠分别在造模前和造模后3、7、14和21d使用VonFrey丝检测右侧足底的机械性缩爪阈值(Mechanical paw withdrawal threshold, MPWT)。运用Westernblot和免疫荧光染色方法检测大鼠脊髓自噬相关蛋白Beclin-1、LC-3II和P62的蛋白表达及细胞分布情况。
实验二：建立大鼠CIBP模型，随机分为四组：sham+vehicle组，CIBP+vehicle组,CIBP+Rap组和CIBP+3-MA+Rap组。CIBP+Rap组在造模后14d腹腔给予自噬激动剂Rap(Rapamycin，雷帕霉素，1，5，10mg/kg)，观察单次腹腔给予Rap对CIBP大鼠疼痛行为学的作用；在14-18d连续腹腔给予Rap，观察Rap连续腹腔注射对CIBP大鼠MPWT的作用。CIBP+3-MA+Rap组14d在注射Rap前0.5h先腹腔给予自噬抑制剂3-MA(3-Methyladenine，3-甲基腺嘌呤，20mg/kg)，观察自噬抑制剂3-MA对自噬激动剂Rap减轻骨癌痛作用的影响。利用Westernblot和免疫荧光方法检测自噬激动剂及自噬抑制剂对大鼠脊髓自噬相关蛋白Beclin-1、LC-3II和P62的表达水平及细胞分布情况的影响。
结果：
na?ve组和sham组大鼠的MPWT未见明显改变，但CIBP组大鼠的MPWT在模型建立后7d明显降低，并且持续至造模后21d。造模后14d单次腹腔给予Rap1mg/kg对CIBP大鼠的MPWT没有明显影响，但是按5mg/kg和10mg/kg剂量单次给予Rap能够明显提高CIBP大鼠的MPWT，且表现为剂量依赖性。5mg/kg组在药物注射后2h开始起效并达峰值，4h失效；10mg/kg组在注射后1h开始起效，2h达峰，6h药效消失。14-18d按5mg/kg和10mg/kg剂量连续腹腔给予Rap明显提高CIBP大鼠的MPWT。提前腹腔注射自噬抑制剂3-MA明显逆转了Rap对CIBP组大鼠的疼痛缓解效果。Westernblot和免疫荧光染色结果显示，CIBP大鼠脊髓的自噬相关蛋白Beclin-1、LC-3II和P62蛋白表达量明显增加；14-18d连续腹腔注射Rap进一步上调CIBP大鼠脊髓Beclin-1和LC-3II的蛋白表达，而P62的蛋白表达被显著抑制；且该效果被提前腹腔注射自噬抑制剂3-MA所逆转。Beclin-1、LC-3II和P62只分布于脊髓神经元，不与星形胶质细胞和小胶质细胞共表达。
第二部分抑制NLRP3炎症小体信号通路缓解骨癌痛
方法：
实验一：选择成年雌性SD大鼠，随机分为正常对照组、假手术组和骨癌痛组，建立大鼠骨癌痛模型过程同第一部分。分别在建模前和建模后3、7、14和21d检测大鼠右侧足底的MPWT，采用Westernblot和免疫荧光方法检测大鼠脊髓NLRP3炎症小体重要组成成分NLRP3、ASC和Caspase-1及其下游效应分子IL-1β的蛋白表达及细胞分布变化情况。
实验二：建立大鼠CIBP模型，随机分为四组：sham+vehicle组，sham+MCC950组，CIBP+vehicle组和CIBP+MCC950组。14d腹腔给予NLRP3特异性抑制剂MCC950(1，5，10mg/kg)，观察单次给予NLRP3特异性抑制剂对CIBP大鼠疼痛行为学的作用。在14-18d连续腹腔给予MCC950，观察多次注射NLRP3特异性抑制剂对CIBP大鼠MPWT的作用。利用Westernblot和免疫荧光染色方法检测大鼠脊髓NLRP3炎症小体重要组成成分NLRP3、ASC和Caspase-1及其下游效应分子IL-1β的蛋白表达及细胞分布变化情况。
结果：
行为学结果显示，在建模后14d单次注射MCC9501mg/kg没有明显改变CIBP大鼠的MPWT，但腹腔给予MCC9505mg/kg和10mg/kg能够明显提高CIBP大鼠的MPWT，且表现为剂量依赖性。5mg/kg组给药后1h开始起效，2h达高峰，6h药效消失；10mg/kg组给药后0.25h开始上升，2h达高峰，12h药效消失。而且，在14-18d连续腹腔给予MCC950明显提高CIBP大鼠的MPWT。Westernblot和免疫荧光染色结果显示，NLRP3炎症小体重要组成成分NLRP3、ASC和Caspase-1及其下游效应分子IL-1β在CIBP大鼠脊髓的蛋白表达明显增加，但连续腹腔给予MCC950下调其蛋白表达。其中NLRP3和IL-1β主要分布于脊髓神经元细胞中，极少数分布于小胶质细胞和星形胶质细胞；ASC仅分布于脊髓神经元，不与小胶质细胞及星形胶质细胞共表达；Caspase-1主要分布于脊髓神经元细胞，极少数分布于星形胶质细胞，不与小胶质细胞共表达。
第三部分自噬调控NLRP3炎症小体信号通路缓解骨癌痛
方法：
选择雌性SD大鼠，建立CIBP模型方法同第一部分，随机分为四组：sham+vehicle组，CIBP+vehicle组,CIBP+Rap组和CIBP+3-MA+Rap组。CIBP+Rap组在造模后14-18d连续腹腔给予自噬激动剂Rap10mg/kg,CIBP+3-MA+Rap组14-18d腹腔给予Rap10mg/kg治疗前0.5h先腹腔给予自噬抑制剂3-MA20mg/kg。取大鼠脊髓组织，利用Westernblot和免疫荧光染色方法检测NLRP3炎症小体重要组成成分NLRP3、ASC和Caspase-1及其下游效应分子IL-1β在大鼠脊髓的表达变化情况。
结果：
免疫荧光和Westernblot结果显示，与sham+vehicle组相比，NLRP3炎症小体重要组成成分NLRP3、ASC和Caspase-1及其下游效应分子IL-1β在CIBP+vehicle组的大鼠脊髓中的蛋白表达明显增加；在CIBP+Rap组，连续腹腔给予Rap显著下调其蛋白表达；但在CIBP+3-MA+Rap组，该效果被提前给予自噬抑制剂3-MA所阻断，上述分子的蛋白表达明显增加。
统计学分析
所有实验数据统计学分析均使用GraphPadPrism5软件，计量资料统一采用均数±标准误表示。行为学结果使用双因素方差(two-way ANOWA)分析，Westernblot结果使用单因素方差(one-way ANOVA)分析。p＜0.05认为差异具有统计学意义。
研究总结
1.主要研究结果
1.1.CIBP大鼠脊髓自噬相关蛋白Beclin-1和LC-3II表达增加，表明自噬被激活。腹腔给予自噬激动剂Rap显著上调自噬相关分子的蛋白表达水平，且明显缓解CIBP大鼠的疼痛行为学；但Rap改善骨癌痛症状的效果被提前腹腔给予自噬抑制剂3-MA所逆转。
1.2.CIBP大鼠脊髓NLRP3炎症小体信号通路激活，其重要组成成分NLRP3、ASC和Caspase-1及其下游效应分子IL-1β的蛋白表达水平显著上调。腹腔给予NLRP3特异性抑制剂MCC950明显缓解CIBP大鼠的MPWT，且呈剂量依赖性。连续腹腔给予MCC950显著下调NLRP3、ASC和Caspase-1及其下游效应分子IL-1β的蛋白表达水平。
1.3.连续腹腔给予自噬激动剂Rap显著抑制NLRP3炎症小体重要组成成分NLRP3、ASC和Caspase-1及其下游效应分子IL-1β的蛋白表达水平，但该作用被提前腹腔给予自噬抑制剂3-MA所逆转。
2.研究结论
2.1.CIBP大鼠脊髓自噬被激活，且自噬激动剂Rap能明显减轻骨癌痛。
2.2.NLRP3炎症小体信号通路介导骨癌痛的发生和发展。
2.3.抑制NLRP3炎症小体信号通路是自噬激动剂缓解骨癌痛的重要机制之一。
3.创新之处
3.1.证实了自噬在CIBP发生和发展中的作用。
3.2.揭示了NLRP3炎症小体信号通路参与CIBP的发生和发展。
3.3.揭示了自噬激活通过调控NLRP3炎症小体信号通路缓解骨癌痛的具体机制。
4.展望
4.1.本研究揭示了自噬激动剂Rap显著缓解骨癌痛大鼠机械性痛觉异常，但自噬是维持细胞内环境稳定的重要机制之一，其过度激活是否会加重细胞失衡使骨癌痛加剧有待进一步验证。
4.2.该研究发现自噬可调控NLRP3炎症小体信号通路，然而NLRP3炎症小体信号通路是否能反向调控自噬，仍需要进一步探究。
4.3.由于自噬的生物学功能十分复杂，NLRP3炎症小体信号通路是否是其作用的唯一通路尚未确定，自噬参与骨癌痛的其他机制有待进一步探讨。