棉铃虫(Helicoverpa armigera Hubner)是一种世界性害虫,是转基因Bt抗虫棉花(Bt棉)的重要靶标害虫之一。我国自1997年开始种植Bt棉,目前在黄河流域和长江流域棉区Bt棉种植面积已达棉花总面积90%以上,在新疆棉区Bt棉仅占10%左右,北疆尚未种植Bt棉。大面积种植Bt棉势必带来棉铃虫的抗性风险问题。对室内筛选获得的棉铃虫Bt抗性品系的研究表明,棉铃虫钙粘蛋白基因突变可以对Bt毒素CrylAc产生高水平抗性。在黄河流域棉区和长江流域棉区棉铃虫田间种群,已经检测到与CrylAc抗性相关的多个钙粘蛋白基因突变型。本研究以F1代检测法对尚未种植Bt棉的北疆沙湾棉铃虫种群进行钙粘蛋白基因突变的检测与鉴定,该研究结果将有助于明确田间棉铃虫种群钙粘蛋白基因突变的起始频率和基因突变的多样性,为新疆棉区棉铃虫Bt抗性的监测预警和抗性治理提供理论依据。1. F1代检测法的建立和验证在棉铃虫CrylAc抗性品系SCD-rl(钙粘蛋白基因r1突变纯合品系)内建立10个单对系,采用1μg/cm2Cry1Ac对其F1代进行检测,10个单对系F1代的存活率均>90%；在SCD-rl抗性品系和SCD敏感品系间建立10个单对系,采用1μg/cm2Cry1Ac对其F1代进行检测,10个单对系F1代的存活率均<10%。因此,1μg/cm2Cry1Ac可以作为F1代检测法的区分剂量。根据前期研究结果,确定以下标准以判断田间个体钙粘蛋白基因型：(1)田间个体与室内抗性品系(rlrl)单对系F1代在Cry1Ac区分剂量下的存活率<30%,田间个体为钙粘蛋白敏感基因型；(2)存活率在30%与70%之间,田间个体为钙粘蛋白基因突变杂合子；(3)存活率>70%,田间个体为钙粘蛋白突变纯合子。为了验证上述方法的可靠性,将2009年采自北疆沙湾的棉铃虫雄蛾和SCD-r1雌蛾进行单对杂交,对其F1代用Cry1Ac区分剂量进行检测。其中,SW144单对系F1代在区分剂量下的存活率为44.4%,表明该单对系田间个体为钙粘蛋白基因突变杂合子。对F1代存活幼虫钙粘蛋白cDNA进行了克隆和分析,发现田间个体携带的钙粘蛋白cDNA在第781bp处缺失96bp,导致氨基酸序列在196位提前终止。该结果证明了本文所建立的F1代检测法具有可行性和可靠性。2.北疆棉铃虫沙湾田间种群钙粘蛋白基因突变的检测与鉴定2010年在北疆沙湾灯诱田间雄蛾,并与抗性品系SCD-rl雌蛾进行单对杂交。共建立了208个单雌系,产生有效卵的为105个,单对配对成功率为50.5%。对产生有效卵的单对F1代用CrylAc区分剂量(1μg/cm2)进行处理,发现6个候选单对的田间亲本可能为钙粘蛋白基因突变杂合子。将这6个候选单对F1代存活者和室内敏感品系SCD杂交,对其杂交后代以CrylAc区分剂量进行处理,检测结果表明,田间亲本抗性基因都为隐性。对6个候选单对系F1代存活幼虫钙粘蛋白cDNA分别进行克隆和测序。SW60单对系田间亲本钙粘蛋白cDNA在第23bp处缺失348bp,导致钙粘蛋白信号肽和第一个重复结构域之间缺失116个氨基酸；SW80单对系田间亲本则在第15个外显子末尾缺失12bp,导致4个氨基酸缺失(801YTIT804); SW84单对系田间亲本在第3275个碱基G突变为A,产生终止密码子TGA,导致翻译提前终止。但是,在SW2、SW33和SW155单对系田间亲本中,钙粘蛋白基因序列完整,与SCD品系的相比仅存在氨基酸多态性；该结果表明,钙粘蛋白基因可能通过氨基酸变异导致对Cry1Ac产生抗性。与我国黄河流域棉区和长流流域棉区棉铃虫田间种群一样,北疆沙湾棉铃虫种群钙粘蛋白基因突变也具有多样性。根据F1筛选的检测结果估算,北疆沙湾棉铃虫种群钙粘蛋白基因突变的频率为0.028。由于北疆尚未种植Bt棉,可以认为沙湾棉铃虫种群具有相对较高的钙粘蛋白基因突变起始频率,预示着沙湾棉铃虫种群对CrylAc具有较高的抗性风险。