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背景与目的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。小干扰RNA (short interfering RNA, siRNA)靶向促血管形成因子,抑制肿瘤血管形成是治疗肺癌的有效策略,但治疗靶点单一,易出现继发性耐药,且必须与传统化疗药物联合使用。5’端三磷酸化的RNA是胞浆模式识别受体视磺酸诱导基因(Retinoic acid inducible gene-I, RIG-I)的配体分子,天然由RNA病毒在胞内生成,可诱导机体固有免疫。本研究将RIG-I配体活性引入到血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)特异性siRNA,构建5’端三磷酸化的VEGF-siRNA,能够模拟RNA病毒,使其同时具有三种独特抗肿瘤功能：1、序列特异性沉默肿瘤VEGF表达,抑制肿瘤血管形成；2、激活RIG-I活性,诱导机体抗肿瘤免疫,阻断肿瘤免疫逃逸；3、诱导肿瘤细胞内源性凋亡及不完全自噬,杀灭肿瘤细胞。以期突破传统抗血管治疗靶点单一且必须与化疗药物联合应用的局限。材料与方法1.体外构建5’端携带有三磷酸基团的靶向VEGF的siRNA (ppp-VEGF),选择A549、H1299、LLC三株NSCLC细胞系,分别转染OH-Con、OH-VEGF、 ppp-Con、ppp-VEGF四种siRNA,使用qRT-PCR、Western-blot、Elisa方法检测细胞中VEGF在RNA及蛋白水平的表达,明确ppp-VEGF对于靶基因的抑制作用。同时用划痕实验在HUVEC细胞中明确靶向VEGF的siRNA对于内皮细胞增殖及迁移的抑制作用,使用Matrigel明确ppp-VEGF是否可抑制内皮细胞血管网络形成。2.在肿瘤细胞中分别转染OH-Con、OH-VEGF、ppp-Con、ppp-VEGF四种siRNA,检测细胞内及细胞上清中的炎性因子IP-10、IFN-β表达量,用流式细胞技术检测细胞表面MHC-I/HLA的表达情况,明确ppp-siRNA诱导机体固有免疫及抑制肿瘤介导的免疫逃逸的功能。为进一步明确ppp-siRNA诱导机体固有免疫机制,首先使用、vestern blot方法检测ppp-siRNA是否可激活肿瘤细胞内RIG-I信号通路,后构建特异性靶向RIG-I及线粒体抗病毒分子(mitochondrial antiviral signaling, MAVS)的sRNA,将这两个分子分别靶向性抑制后再次检测1ppp-siRNA对于IP-10、IFN-β的诱导功能的变化,以明确RIG-I信号通路在1ppp-siRNA诱导免疫过程中的作用。3.采用Anexin V/PI流式检测ppp-siRNA处理后细胞的凋亡状态,同时用MTT、台盼兰计数明确ppp-siRNA对于肿瘤细胞增殖及存活的影响。对于ppp-siRNA杀灭肿瘤的机制,首先通过qRT-PCR及western blot方法明确ppp-siRNA是否可通过激活BH3-only家族的Noxa蛋白,激活内源性凋亡通路,杀灭肿瘤细胞。另外,为明确模拟病毒RNA的ppp-siRNA是否可通过诱导肿瘤细胞自噬实现杀灭肿瘤细胞的目的,使用western blot方法检测肿瘤细胞中LC3-Ⅱ的堆积情况,后通过自噬相关基因的特异性siRNA处理后进一步检测ppp-siRNA诱导凋亡和抑制增殖的功能,明确自噬在ppp-siRNA杀灭肿瘤细胞过程中发挥的作用。4.在C57/BL6小鼠中使用LLC细胞系构建皮下肿瘤模型(共25只小鼠,共分5组),在肿瘤生长至0.5cm左右使用OH-VEGF、ppp-Con、ppp-VEGF分别进行瘤内转染(1次/3日,共注射3次)或不进行处理(瘤内注射5%葡萄糖),第3次注射后2日处死小鼠,取出肿瘤组织,部分进行CD31染色及HE染色,观察瘤内血管网形成情况及肿瘤内细胞坏死情况；剩余组织提取总RNA检测VEGF、免疫分子及凋亡、自噬相关基因表达情况,以明确ppp-VEGF是否可在体内抑制肿瘤血管形成,诱导抗肿瘤免疫并杀灭肿瘤细胞。结果1. ppp-VEGF抑制肿瘤血管形成：OH-VEGF. ppp-VEGF处理的肺癌细胞,VEGF在mRNA表达水平与OH-Con、ppp-Con组相比显著下调(OH-Con vs OH-VEGF:P<0.01; ppp-Con vs ppp-VEGF:P<0.05)。在western blot及Elisa上清检测中,靶向VEGF的siRNA对于靶基因的抑制作用得到进一步验证(()H-Con vs OH-VEGF:P<0.05; ppp-Con vs ppp-VEGF:P<0.05)。 HUVEC细胞株中进行划痕实验,可发现ppp-VEGF处理组HUVEC细胞迁移率明显慢于其他处理组(处理24h后统计迁移率差异,OH-Con vs OH-VEGF: P<0.01; ppp-Con vs ppp-VEGF:P<0.01)。在Matrigel中观察内皮细胞血管网形成,发现ppp-VEGF处理后,血管网形成长度及分支血管点数量均明显减少,差异具有统计学意义(P<0.01)。2. ppp-VEGF诱导机体抗肿瘤免疫：肿瘤细胞经ppp-siRNA处理后,IP-10及IFN-β在mRNA水平表达显著上调(OH-Con vs ppp-Con:P<0.01; OH-VEGF vs ppp-VEGF:P<0.01),在A549细胞上清中,这两种免疫相关分子的表达亦显著升高。同时,肿瘤细胞表面MHC-I/HLA的表达量亦显著上调,可抑制肿瘤免疫逃逸。ppp-siRNA可明显增加RIG-I及其下游信号分子MAVS的表达。而将这两个分子分别抑制后,ppp-siRNA诱导的IP-10及IFN-β的表达均明显下调,提示ppp-siRNA主要通过RIG-I信号通路发挥诱导免疫功能。3. ppp-VEGF诱导肿瘤细胞内源性凋亡及不完全自噬：使用ppp-siRNA处理细胞后,Annexin-V阳性细胞比例明显增加,同时MTT及台盼兰计数显示活细胞比例显著下调(P<0.05)。ppp-siRNA所处理细胞经qRT-PCR及western blot检测后发现,Noxa的表达上调。同时ppp-siRNA可诱导肿瘤细胞自噬,LC3-Ⅱ堆积。抑制自噬相关基因后ppp-siRNA杀灭肿瘤细胞的活性明显减少。提示ppp-siRNA可能是通过诱导内源性凋亡途径及肿瘤不完全自噬实现肿瘤细胞杀灭的作用。4. ppp-VEGF的多种杀瘤功能在体内进行验证：小鼠肿瘤组织取出后,经qRT-PCR检测提示肿瘤局部VEGF的表达可被OH-VEGF (P<0.05)及ppp-VEGF (P＜0.01)显著抑制,同时血管网络形成减少,而免疫分子IL-12的表达则可被ppp-siRNA上调(P<0.05)。HE染色发现,ppp-siRNA瘤内注射后,细胞坏死比例明显增加。提示ppp-VEGF在小鼠体内可抑制肿瘤局部血管形成,诱导抗肿瘤免疫,杀灭肿瘤细胞。结论与意义1. ppp-VEGF的抗肿瘤血管作用：体外能通过ppp-VEGF抑制肿瘤细胞中VEGF表达,进而抑制HUVEC细胞的增殖、迁移及血管网络形成；体内通过瘤内注射ppp-VEGF,瘤内VEGF表达降低,肿瘤血管密度减少；2. ppp-VEGF的抗肿瘤免疫功能：通过诱导RIG-I信号通路,ppp-VEGF可诱导IFN-β产生,同时激活多种细胞因子,产生抗肿瘤免疫；同时可上调MHC-I表达,抑制肿瘤细胞介导的免疫逃逸；3. ppp-VEGF的促肿瘤细胞死亡作用:ppp-siRNA可激活内源性凋亡通路,同时诱导肿瘤细胞不完全自噬,促进肿瘤细胞死亡；4.靶向VEGF的多功能小干扰RNA(ppp-VEGF)可同时发挥抑制肿瘤血管形成、诱导抗肿瘤免疫及促进肿瘤细胞死亡功能,克服了传统抗血管治疗必须与传统化疗联合及易出现继发性耐药等缺点,为开发新一代多功能抗肿瘤RNAi药物提供理论技术基础,具有临床转化和产业化前景。