甘蓝型油菜SBT基因家族鉴定及Bna.C01SBT1.4的功能解析

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油菜(Brassica napus)是世界第五大作物,也是我国重要油料作物。但是由于我国人口众多,种植面积有限,因此,油菜产量的提高对解决我国的植物油资源紧缺等问题都有极其重要的意义,有助于保障我国油料供给安全。油菜产量主要由有效角果数、每角实粒数和千粒重组成,而油菜生物量积累机制的研究将有助于提高油菜的产量。枯草杆菌蛋白酶(SBT)是丝氨酸蛋白酶家族的第二大家族。枯草杆菌蛋白酶参与植物胚胎发生、角皮层和表皮形成、种子分化和发育、器官脱落、程序性细胞死亡、以及植物对生物和非生物环境的响应。目前已经在拟南芥、葡萄和番茄等物种鉴定出了大量的SBT基因家族成员,但是在油菜中还未开展系统地研究的分析。本研究对甘蓝型油菜SBT基因家族成员进行鉴定和生物学信息分析,并对角果数相关的Bna C01g37240(Bna.C01SBT1.4)进行了初步的基因功能解析。主要结果如下:1.甘蓝型油菜SBT基因家族全基因组鉴定与分析在甘蓝型油菜全基因组中鉴定出144个SBT基因家族成员,理化性质分析表明,等电点为5.08-9.58,基酸数目为212 aa-1424 aa,平均氨基酸数为723 aa。蛋白质亚细胞定位分析发现,140个成员位于细胞壁。系统进化分析发现,SBT家族可分为6个亚家族,SBT1/3/4/5、SBT2和SBT6亚家族分别起源于三个祖先拷贝。与SBT2和SBT6祖先拷贝相比,SBT1/3/4/5祖先拷贝在进化过程中经历了更多的基因复制和分化事件。染色体定位分析发现,除在A06、C06和C08染色体未有分布外,120个基因不均匀地分布于16条染色体上,24个基因在染色体的位置信息未知,25个基因存在串联重复。SBT家族中SBT1基因成员外显子较少,其余的亚家族成员均含有8个以上的外显子,SBT6亚类三个成员基因结构差异很大,SBT6.1两个拷贝含有10个外显子,而SBT6.2拷贝含有20个以上的外显子。芸苔属SBT基因家族共线性分析表明,在共线性区域内,白菜中有28个SBT,甘蓝中有25个SBT,甘蓝型油菜中有64个SBT。基因表达模式分析表明,SBT1/2/6类群成员的基因比SBT3/4/5类群成员的基因表达宽度普遍要高,SBT1中Bna.SBT1.4a/b/c/d、Bna.SBT1.7f/g、Bna.SBT1.8a/b在检测的所有组织中表达水平较高,SBT2/4中的大多数成员都是仅在某几个组织表达,在大多数组织中不表达或表达量很低,SBT6类群成员跟SBT1.4成员表达模式相似,在检测的所有组织中表达量较高。2.Bna.C01.SBT1.4基因功能的研究本研究以甘蓝型油菜“中双11”为研究材料,通过改进的Gateway重组技术构建植物的过表达载体和启动子表达载体,通过转化拟南芥获得转基因植株,筛选得到16株T0代过表达转基因阳性植株和11株T0代启动子转基因阳性植株。过表达转基因阳性植株播种至T3代进行表型观察,发现在抽薹时期比野生型长势弱小且提前抽薹,表明生物量积累不足可能导致提前抽薹。GUS组织染色发现Bna.C01SBT1.4在莲座叶和花中表达,且在苗期时主要在分裂活跃的新生的莲座叶组织中表达。利用洋葱内表皮亚细胞定位方法确定Bna.C01SBT1.4是核膜共存的蛋白,利用基因重组技术构建酵母诱饵载体pGBKT7-Bna.SBT1.4,检测对酵母细胞不产生毒性且无自激活,通过酵母双杂交实验,获得270个可能与之互作的蛋白,进行GO富集分析后发现,主要集中在氨基酸代谢途径,选择其中12个可能与之互作的蛋白进行后续的点对点验证。
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