海洋甾体(又称甾醇类化合物)是来源于海洋牛物体内的一大类重要的天然化学成分，它们许多独特的结构是在陆牛牛物体内所不曾发现的。迄今为止对海洋甾体的研究重点涉及其溶血、抗炎、细胞毒和抗肿瘤、抗菌、抗真菌、抗病毒等药理特性。木实验室的前期研究表明，从南沙群岛唇软珊瑚中提取的四羟基甾醇(氧代固醇)类化合物YC-1能够抑制低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡，这是首次报道海洋甾体具有神经保护作用。然而，由于YC-1目前只能从南沙群岛唇软珊瑚等少数海洋生物中提取得到，采集不易和越来越严格的海洋环境保护使其来源十分有限，而且YC-1在这些牛物体内的含量极微，加上提取步骤烦琐低效，造成天然品YC一1的纯度有限、成木相当昂贵，难以实现工业化生产，大大阻碍了对YC-1药理学机制的深入研究。目前，本实验室以廉价的猪去氧胆酸为原料，通过化学合成的方法得到了YC-1。本文主要是探讨化学合成的新的海洋甾体YC-1在细胞水平和动物模型上是否对脊髓缺血损伤有神经保护作用。希望能为海洋甾体应用于临床提供理论基础，并为药物防护脊髓缺血损伤提供新思路。第一部分实验一目的：探讨脊髓运动神经元的分离、纯化及体外培养方法，寻找有效的鉴定途径。方法：孕15d大鼠脊髓组织经胰酶消化，采用6.8％的碘葡酰胺(metrizamide)密度梯度离心，差速贴壁，阿糖胞苷抑制非神经元细胞的分裂增殖及无血清限定性培养基等措施以获得相对纯化的运动神经元。应用免疫细胞化学及免疫荧光技术以胆碱乙酰转移酶多克隆抗体(ChAT)特异性标记脊髓运动神经元，并采用共聚焦显微镜更加清楚地显示细胞的结构。结果：脊髓运动神经元呈ChAT阳性反应，能够存活7～9d左右，培养纯度可达85％。结论：本实验提供了一种成功培养脊髓运动神经元的方法，ChAT能够特异性标记脊髓运动神经元。实验二目的：利用体外培养的脊髓运动神经元模型，探讨海洋甾体YC-1是否能够抑制谷氨酸对脊髓运动神经元的神经毒性作用。方法：将培养的运动神经元随机分为：对照组(Control)：培养基巾不加药液：谷氨酸组(GIu)：培养基中加入300μmol/L谷氨酸；YC-1+谷氨酸组(YC-1+Glu)：培养基中预先加入15mol/LYC-1孵育30min后，再加入300μmol/L谷氨酸；DMSO+谷氨酸组(DMSO+Glu)，培养基中预先力加入等容量DMSO孵育30min后，再加入300μmol/L，谷氨酸。24h后，用相差显微镜观察神经元的形态并对神经元计数：然后用MTT和乳酸脱氢酶(LDH)测定等方法评估YC-1对脊髓运动神经元谷氨酸毒性损伤的影响。结果：与谷氨酸组相比，YC-1+谷氨酸组的脊髓运动神经元计数、存活率均有明显提高(P<0.05)，LDH释放量明显下降(P<0.05)。而与谷氨酸组相比，DMSO+谷氨酸组的神经元计数、存活率及LDH释放量均无明显差别。结论：YC-1保护脊髓运动神经元抗谷氨酸的神经毒性作用。 第二部分实验一目的：探讨阻断腹丰动脉不同时间对兔脊髓缺血损伤程度的影响，以寻找较适宜的脊髓缺血时间，为下一步实验奠定基础。方法：采用腹.丰动脉肾下段夹闭法，建立兔脊髓缺血模型。30只新西兰大白兔，均分成下面5组(n=6)：阻断腹丰动脉10分钟(110)、20分钟(120)、30分钟(130)、40分钟(140)及假手术(Sham)组。假手术组兔仪暴露腹丰动脉，而不阻断它。再灌注后4、8、12、24和48小时对兔后肢运动神经功能评分。兔后肢运动神经功能评分采用Tarlov标准：0分，后肢完全瘫痪：1分，可以觉察的后肢关节运动；2分，后肢可以自由运动但无法站立：3分，可以站立但无法行走；4分，后肢运动功能完全恢复，可以正常行走。评分完毕后，截取腰段脊髓组织(L5一L7)，行HE及TLJNEL染色。光镜下观察HE染色结果并对脊髓前角正常神经元计数；并通过TUNEL染色检测脊髓前角神经元的凋亡。结果：再灌注后各个时间点，I40组兔一直表现为完全瘫痪(0分)；而I10组兔在再灌注后各个时间点除一只兔不能站立外，其余全部正常(4分)；I20和I30组兔后肢运动神经功能介于I10组和I40组之间。光镜下可见I40组兔脊髓损伤严重，整个脊髓切片呈大量的空泡变性；I10组兔脊髓损伤轻微；I20和I30组兔脊髓损伤程度介于I10组和I40组之间。I10组兔与假手术组兔的运动神经功能评分和脊髓前角正常神经元计数组间比较均无统计学意义(P>0.05)，但明显多于其余3组；I20组兔的运动神经功能评分和前角正常神经元计数与I30组兔相似(P>0.05)，但均明显多于I40组。I40及假手术组基本未见TUNEL阳性神经元：I20组脊髓前角TUNEL阳性神经元计数明显多于I40及假手术组；但与I10及I30组兔相似(P>0.05)。结论：I10组兔脊髓损伤轻微，不宜选为我们评价药物脊髓保护作用的模型；140组兔脊髓损伤严重，这对评价缺血预处理脊髓保护作用可能不够敏感。且脊髓前角基本未见TUNEL染色阳性神经元，这也不利于研究和观察脊髓缺血后运动神经元的凋亡，相比较其它四组，120组兔作为评价药物脊髓保护作用的动物模型，是最适宜的。实验二目的：探讨YC-1是否对兔脊髓缺血损伤有保护作用。方法：新西兰大白兔均分成4组：对照组在脊髓缺血前不进行其它处理；YC-1组在脊髓缺血前30分钟经耳缘静脉注射8mg.Kg-YC-1；DMS0组即在脊髓缺血前30钟同样方式注射等容量DIdSO(1ml-Kg-1)；Sham组即仅仅暴露腹丰动脉，而不阻断它。脊髓缺血采用夹闭腹丰动脉肾下段20min。再灌注后48小时后对兔后肢运动神经功能评分。神经功能评分完毕后，立即取腰段脊髓组织(L5-7)观察脊髓组织病理学改变并测定脊髓组织中乳酸水平、乳酸脱氢酶及Na+，K+-ATP酶的活性。结果：YC-1组的神经功能评分和脊髓前角正常神经元计数明显高于对照组和DMSO组。对照组和DMSO组形态正常的神经元稀少，脊髓损伤较重：而YC-1组中脊髓损伤明显减轻。YC-1组的脊髓组织乳酸水平、乳酸脱氢酶的活性明显低于对照组对照组和DMS0组；而Na+，K+-ATP酶活性却明显高于对照组和DMSO组。 结论：YC-1对兔脊髓缺血损伤有明显的保护作用。