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细胞系是研究鱼类病毒学、分子致癌、细胞毒理学和功能基因组学等的重要体外研究体系,同时,也是分离和研究引起大规模流行病爆发和死亡的鱼类病毒的重要工具。
本试验取金鱼的鳍条为材料,建立了金鱼尾鳍细胞系,命名为GFTF细胞系。在15个月的时间里,GFTF细胞系已传代超过50代,细胞主要为呈纤维样细胞。结果显示GFTF细胞能在15℃至37℃中生长,最适温度是25℃。研究还发现随着血清浓度的升高,细胞的生长速度显著增加,最适血清浓度为20％。染色体数目在88到112都有分布,其峰值在104。用五种病毒对细胞的敏感性进行测定。结果显示,乌鳢弹状病毒(snakehead rhabdovirus,SHRV)、鲤春病毒血症病毒(spring viremia carp virus,SVCV)和斑点叉尾鮰病毒(channel catfish virus,CCV)均能感染GFTF细胞系,同时病毒蚀斑试验也证实了这一点。细胞对病毒的敏感性试验还显示,该细胞系对CCV病毒的敏感性和病毒复制能力比其对照细胞斑点叉尾鮰卵巢细胞系(channel catfish ovary,CCO)更强,表明GFTF细胞系可用作鱼类病毒的检测工具,同时也可以用来分离鱼类病毒。使用绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)真核表达载体转染此细胞后,48h内即可明显看到细胞内有绿色信号荧光蛋白的表达,表明GFTF细胞系在转基因研究中具有潜在应用价值。
本研究还以神仙鱼脾脏组织为材料,建立了神仙鱼脾脏细胞系,命名为AFSP细胞系。在17个月的时间里,AFSP细胞传代超过45代,细胞主要为呈纤维样细胞。室温25℃条件下,AFSP细胞在含20％小牛血清的L-15培养基和M199培养基以1:1比例混合的培养基里培养。通过测定细胞的存活率发现,在液氮(-196℃)中保存不同代数的细胞数月后,细胞能保持很高的存活率。新建立的AFSP细胞系被用来测定其对四种鱼类弹状病毒(传染性造血器官坏死病毒,Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV；乌鳢弹状病毒,Snakeheadrhabdovirus,SHRV；鲤春病毒血症病毒,Spring viremia carp Virus,SVCV；病毒性出血败血症病毒,viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV)和一种鱼类疱疹病毒(斑点叉尾鮰病毒,Channel catfish virus,CCV)的敏感性。病毒的TCID50测定和病毒蚀斑试验结果均表明,这五种病毒都能感染AFSP细胞,并能在其中进行复制。并且AFSP细胞对IHNV、VHSV和SHRV有较高的敏感性。神仙鱼脾脏细胞系对多种病毒敏感的结果显示,在研究神仙鱼病毒和其他鱼类病毒方面,神仙鱼脾脏细胞系可能成为一种较好的研究工具。
另外,本研究克隆了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)免疫球蛋白D重链基因,并研究了它们在各组织器官中的表达。采用RACE-PCR的方法扩增到草鱼IgD重链的cDNA部分片段3549bp,其中编码区3189bp,编码1063个氨基酸,为恒定区部分,非编码区360bp。其恒定区包括μ1、δ1-(δ2-δ3-δ4)2-δ5-δ6-δ7和一个跨膜区。鱼类IgD恒定区氨基酸序列比对结果显示,草鱼IgD存在半胱氨酸和色氨酸保守位点,与其他鱼类IgD的相似性在23.9％-56.4％之间。用邻接法(Neighbor Joining)构建的鱼类免疫球蛋白基因的系统发育树表明,鱼类IgD形成独立的一支,草鱼IgD与斑马鱼IgD聚为一支。荧光定量PCR结果显示,草鱼IgD的mRNA主要分布于头肾、中肾和脾脏中。根据IgD的开放阅读框设计表达引物,扩增片段捅入表达载体pET-32a,构建重组表达质粒,经测序无误后,将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导下实现了高效表达,以包涵体形式表达。变性条件下利用亲和层析柱成功纯化融合蛋白,将其免疫大耳白兔,获得兔抗IgD的抗血清,经免疫印迹检测到纯化后的重组蛋白能够被兔多克隆抗体识别,证明其可用。