论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的接触性传染病。该病主要引起妊娠母猪早产、流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍以及各年龄段猪的呼吸道症状和高死亡率。该病于1987年首先发现于美国，随后波及多个国家和地区。郭宝清在1996年首次从流产胎儿中分离到PRRSV，证实了PRRSV在我国的存在（郭宝清，1996）。该病造成较高的发病率和死亡率，而且临床症状逐渐复杂，流行范围逐渐扩大。目前PRRS已经遍及全球主要养猪的国家和地区，且尚无有效的疫苗能够控制该病的发生，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。波形蛋白作为PRRSV受体之一，与其他中间丝蛋白一起在PRRSV感染细胞过程中发挥重要作用，但作用机理尚不明确。为了研究猪波形蛋白在介导PRRSV感染细胞过程中的作用，利用RT-PCR方法从PRRSV非易感细胞系猪肾细胞系PK-15细胞中扩增目的基因，克隆入pET-28a载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。表达的重组猪波形蛋白经SDS-PAGE、Western blot鉴定和提纯后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用病毒阻断试验检测重组猪波形蛋白及多克隆抗体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中的作用。结果表明，猪波形蛋白基因从PK-15细胞中得到成功扩增并克隆入pET-28a载体，经诱导后得到高效表达。重组猪波形蛋白经纯化后具有良好的免疫原性，刺激兔子产生高价血清抗体（105），并有效阻断PRRSV感染Marc-145细胞。兔血清抗体通过特异性结合波形蛋白完全阻断PRRSV感染Marc-145细胞。将本实验室获得的非洲绿猴肾细胞（Marc-145）波形蛋白基因与EmGFP基因、IRES基因共同克隆到pcDNA3.1/V5-His A载体中，成功构建重组质粒pcDNA3.1-GIV。通过非脂质体转染将其转染至BHK-21细胞中，经G418加压筛选，单克隆挑取，获得稳定表达猴源波形蛋白的细胞系BHK-21-GIV。细胞系经Western blot和RT-PCR检测，证明外源波形蛋白成功得到表达。将获得的BHK-21-GIV细胞系与PRRSV进行10次病毒适应传代，通过间接免疫荧光检测，观察到可以感染PRRSV的BHK-21-GIV细胞。同时根据获得的猴源波形蛋白基因序列分别设计了4对引物，结果分别得到了预期的基因片段，其大小分别为：807bp、876bp、1002bp、594bp。将目的基因克隆入pET-28a载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。经SDS-PAGE分析，表达的重组蛋白大小分别约为34.3kD、38.2kD、42.6kD和26.5kD，与预期结果相吻合。经Western-blot检测，所获得的各段重组蛋白均能与抗His-单克隆抗体发生特异性反应。利用I-ELISA方法验证表达的四段重组猴源波形蛋白与PRRSV的核衣壳蛋白N蛋白的关系。结果表明，四段重组猴源波形蛋白得到成功表达，并与PRRSV的核衣壳蛋白N蛋白结合。对PRRSV受体的研究有助于揭示PRRSV与宿主细胞之间的相互关系，有助于阐明PRRSV的融合和进入易感细胞的过程，更有助于揭示PRRSV的致病机制，从而对于PRRSV的预防及控制提供了新的研究思路。这些研究结果为进一步阐明波形蛋白在PRRSV感染细胞过程中的作用提供了新的实验依据。