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RNA介导的病毒抗性是RNAi在植物抗病毒侵染中的一种表现形式,侵入植物细胞的病毒基因组与转基因转录产物具有部分同源性,因此在PTGS所导致的RNA降解过程中,RNA降解系统识别侵入细胞内的病毒基因组并将其与转基因RNA一起降解。新的研究证明发生于不同物种上的RNA沉默的直接引发因子都是双链RNA(double stranded RNA,dsRNA),在不同生物中dsRNA有多种形成方式。对于转基因(正义和反义)来说,dsRNA最有效的形成途径是体外构建具有反向重复结构(Inverted Repeat, IR)的cDNA引入转基因植株,这种IR结构在体内转录后形成发夹RNA(hairpin RNA, hpRNA)。hpRNA中的dsRNA部分决定了反应的特异性,是诱发基因沉默的关键部位,它的长度和来源均影响所诱导的RNA沉默的效率。hpRNA间隔区段的长度可影响转基因转录后hpRNA的形成和稳定性,进而影响基因沉默的效率。一般认为短的间隔序列有利于hpRNA的形成,保持其高度稳定性,获得较高的沉默效率;但研究中也发现间隔序列过短往往影响IR序列在细菌内的稳定性,影响具反向重复结构基因的克隆。适宜的茎环比例,可能是获得高基因克隆效率和高基因沉默效率的关键。本研究选用了PVYNCP基因3’端50bp序列作为hpRNA的茎,以克隆载体pUC19不同长度的序列为环,构建了具有不同茎环比例的hpRNA结构的植物表达载体,转化烟草,研究了茎环比例对RNA介导的病毒抗性产生的影响。研究结果将为高效hpRNA的设计提供依据。具体结果如下:1.分别克隆PVYNCP 3’端704-754之间50bp的片断作为hpRNA结构的茎,以pUC19序列上的部分片段为hpRNA的环,构建植物双元表达载体pROK-4﹕1、pROK-2﹕1、pROK-1﹕1、pROK-1﹕2、pROK-1﹕4和pROK-1:8。2.将所构建的重组植物表达载体pROK-4﹕1、pROK-2﹕1、pROK-1﹕1、pROK-1﹕2、pROK-1﹕4和pROK-1﹕8及空pROKⅡ利用冻融法直接导入农杆菌LBA4404。菌液PCR及酶切鉴定证明质粒均已成功导入农杆菌菌株。3.叶盘法转化烟草NC89。用卡那霉素对再生植株再次抗性筛选、PCR检测,共获得转pROKⅡ的烟草40株,转pROK-4:1的烟草143株,转pROK-2﹕1的烟草152株,转pROK-1﹕1烟草130株,转pROK-1﹕2的烟草135株;转pROK-﹕4的烟草132株;转pROK-1﹕8的烟草126株。4.转基因植株的抗病性分析,以PVYN的病汁液为接种物,汁液摩擦接种转基因烟草。症状观察及ELISA检测表明不同的转基因植株对PVYN的抗性存在差异。从抗病性测试结果来看,在143株转pROK-4﹕1的T0代烟草中,有84株表现高度抗病,抗性植株比例为57.34%;152株转pROK-2﹕1的T0代烟草中,有94株表现高度抗病,抗性植株比例为61.84%;130株转pROK-1﹕1的T0代烟草中,有78株表现高度抗病,抗性植株比例为60.00%;135株转pROK-1﹕2的T0代烟草中,有69株表现高度抗病,抗性植株比例为51.11%;132株转pROK-1﹕4的T0代烟草中有72株表现高度抗病,抗性植株比例为44.69%;126株转pROK-1﹕8的T0代烟草中有12株表现高度抗病,抗性植株比例为9.52%。从发病的情况可以看出转基因植株中抗性植株的比例与茎环比例呈一定相关性。5.分别选取抗病性表现不同(抗病和感病)的部分转基因植株提取总DNA进行Southern blot分析,分析转基因的拷贝数与抗病性间的关系。结果表明转基因的拷贝数与抗病性无明显的相关性。6.转基因植株的Northern blot分析表明,转基因都在RNA水平上得到了表达,抗病性与转基因转录产物的积累量二者呈负相关,即这种抗病性为RNA介导的抗病性,是RNA沉默的结果。