【摘 要】
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大豆胞囊线虫病是大豆生产上危害最严重的病害之一,生物防治以其环境友好、低毒、低残留、对人畜无害等优势受到广泛的关注。本文通过田间筛选试验获得两株可以防控大豆胞囊线虫的生防细菌,评价了盆栽和田间试验的防治效果,并且明确了微杆菌Sneb159诱导抗性的作用机理。分离得到微杆菌Sneb159发酵液中对大豆胞囊线虫二龄幼虫具有毒杀作用的物质。通过顶空固相微萃取结合气相色谱质谱联用(HS-SPME-GC-M
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大豆胞囊线虫病是大豆生产上危害最严重的病害之一,生物防治以其环境友好、低毒、低残留、对人畜无害等优势受到广泛的关注。本文通过田间筛选试验获得两株可以防控大豆胞囊线虫的生防细菌,评价了盆栽和田间试验的防治效果,并且明确了微杆菌Sneb159诱导抗性的作用机理。分离得到微杆菌Sneb159发酵液中对大豆胞囊线虫二龄幼虫具有毒杀作用的物质。通过顶空固相微萃取结合气相色谱质谱联用(HS-SPME-GC-MS)检测了生防细菌挥发性有机物的组成,明确了对大豆胞囊线虫具有抑制作用的物质。主要的研究结果如下:1.生防细菌的初步筛选及鉴定:通过两次田间筛选试验,利用种子包衣处理的方法,从804株细菌中筛选得到两株对大豆根上胞囊抑制率最高的生防菌Sneb159和Sneb517。结合形态学、生理生化、BIOLOG和分子生物学鉴定,最终确定Sneb159为微杆菌Microbacterium maritypicum,Sneb517为阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai。2.生防菌株防治效果评价:Sneb159和Sneb517包衣处理不会影响大豆种子的萌发。盆栽试验的结果显示:经过Sneb159和Sneb517包衣处理可以显著降低大豆胞囊线虫的种群密度,根内线虫数量和胞囊的数量均显著降低。两年的田间试验结果表明,经过Sneb159和Sneb517包衣处理后根内线虫数量和根围土中胞囊数量均显著降低,根上胞囊数量与对照相比无显著差异。盆栽试验和田间试验的结果表明,Sneb159和Sneb517对大豆的生长没有影响,且处理后产量(单株荚数、单株粒数、百粒重)没有显著变化。3.微杆菌Sneb159诱导大豆产生抗性研究:裂根试验的结果表明,Sneb159的灭活发酵液可以诱导大豆产生系统和局部的抗病性,Sneb159与线虫接种在同一侧(B+N)以及分别接种在两侧(B/N)的处理中大豆胞囊线虫的侵染数量都显著低于未处理组(N);三龄和四龄的数量与未处理组相比都显著减少。通过双盆连接试验检测了Sneb159对二龄幼虫趋避性的影响,结果表明经过Sneb159处理后的大豆根系内线虫数量显著低于另一侧无菌水处理组。检测了大豆根部防御酶系、木质素、水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)途径相关基因在线虫侵染期、合胞体形成期和发育期的表达水平。结果显示,在B+N或B/N的处理条件下防御酶系中POD、木质素合成途径中C4H、SA途径中PR2以及JA途径中PR3b的表达量与N相比发生了显著的变化,说明这些途径可能在Sneb159诱导抗性的反应过程中被激活。4.Sneb159杀线虫活性物质分离纯化及结构解析:Sneb159和Sneb517的发酵液对二龄幼虫和卵孵化都具有抑制作用。对微杆菌Sneb159发酵液进行有机溶剂萃取,活性测试的结果表明乙酸乙酯层的活性最高;利用硅胶柱层析法分离得到的组分2023杀线虫活性最高。利用半制备高效液相色谱分离得到物质A6,经过液相色谱检测其纯度为90.27%。经过核磁共振波谱解析该物质的结构,最终鉴定该物质为苯乙酰胺,分子式为C8H9NO。5.生防细菌挥发性有机物杀线虫活性成分鉴定:Sneb159和Sneb517发酵液产生的挥发物对大豆胞囊线虫二龄幼虫和卵孵化均有抑制作用。通过HS-SPME-GC-MS提取并鉴定了其挥发性有机物的成分,结果表明Sneb517和Sneb159产生的气体主要包括了含氮化合物、酮类化合物、硫化物、硅氧烷类化合物、烃类化合物和酯类化合物等。将其中七种物质的纯化合物以浸泡和熏蒸的方式处理二龄幼虫和卵,其中硫化物(二甲基二硫和二甲基三硫)和酮类化合物(6-甲基-2-庚酮和1-苯基-2-丁酮)抑制作用显著。
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