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大口黑鲈是我国淡水养殖的重要经济鱼类之一,近几年中国市场对大口黑鲈的需求量在不断的增大,使得国内大口黑鲈的养殖规模和养殖密度也在不断增加,为此大口黑鲈的疾病特别是病毒性疾病的爆发也越频繁。大口黑鲈病毒(Largemouth Bass Virus,LMBV)属虹彩病毒科蛙病毒属成员之一,可引发养殖大口黑鲈的高死亡率,造成重大的经济损失,目前针对LMBV的有效药物或其疫苗的研制尚未报道。因此,为了预防LMBV带来的病毒性灾害,探索DNA疫苗的免疫机制和效果,论文以表达LMBV外衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)的重组表达质粒p CDNA3.1(+)-MCP为材料,构建对LMBV有免疫作用的DNA疫苗。首先构建能表达抗原蛋白MCP的重组质粒p CDNA3.1(+)-MCP,通过PCR、RT-PCR和Western Blot等方法,从m RNA和蛋白水平检测重组质粒在鱼类细胞中的MCP表达情况。然后通过血液学分析、血清中和抗体效价分析、免疫相关基因的表达分析以及质粒在鱼体的分布情况等分析方法,检测接种后大口黑鲈的免疫水平,最后对免疫后的大口黑鲈进行攻毒试验,检验疫苗的免疫保护率。实验结果表明,p CDNA3.1(+)-MCP重组质粒能在鱼类细胞中正确并持续地转录和表达目的基因,表达蛋白大小为53 k Da,与预期结果一致。通过胸鳍基部注射的方法免疫大口黑鲈,在攻毒实验中DNA疫苗组的免疫保护率达62.5%,极显著高于空载组的23.1%和PBS组的0%,对LMBV的攻击起到了良好的保护作用。大口黑鲈免疫组学分析结果如文所述。在免疫后的第1、7、14、21、28 d对大口黑鲈进行采血及提取肝、脾、头肾组织样品进行鉴定。结果表明:在肝脏、脾脏和头肾组织中均能通过RT-PCR方法检测到p CNDA3.1(+)-MCP的转录表达,免疫后的第7、14 d表达量较高;免疫组红细胞数量在免疫后的第14、21 d显著增高;免疫后的嗜中性粒细胞和单核细胞在白细胞中的占比升高,而淋巴细胞占比降低;血清中和抗体效价测定的结果证明了大口黑鲈血清中存在相应的重组蛋白抗体,疫苗组抗体效价在第14 d达到峰值,为1:(375.00±40.26),随后逐渐下降,但均极显著高于对照组;免疫后,疫苗组大口黑鲈的肝脏、脾脏及头肾组织内IL-8、IL-1β、TNF-α和Mx基因的m RNA表达量均发生了显著的上调,但是随着免疫时间的延长,表达量逐渐降低。综上所述,表达LMBV MCP蛋白的重组质粒能在大口黑鲈体内诱导显著的免疫反应,对LMBV病毒的侵染起到一定的保护作用。因此,此DNA疫苗可作为大口黑鲈对抗LMBV病毒的潜在候选疫苗,为研究大口黑鲈免疫机制和今后生产应用及产业化提供了材料和一定的理论基础。