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近年来，随着分子心血管病学研究的进展，发现在心血管系统的许多生理和病理变化中存在有细胞凋亡现象。1994年，Gotllieb等在对家兔的研究中证实缺血／再灌注可引发心肌细胞凋亡；1997年，Saraste等发现人的心肌缺血／再灌注损伤中也存在有凋亡现象。目前认为细胞凋亡是导致心肌缺血／再灌注损伤的重要因素，但关于心肌缺血／再灌注时引起细胞发生凋亡的机制尚不清楚。过去的大量研究表明，白细胞尤其是中性粒细胞(PMN)与心肌缺血／再灌注损伤有密切关系，并认为其作用机制可能是由于在病理状态下，PMN高表达粘性糖蛋白而大量粘附聚集在缺血／再灌注区，通过释放各种细胞因子和氧自由基等炎症介质引起组织损伤。鉴于PMN在缺血／再灌注损伤中的重要作用，人们开始关注PMN与心肌细胞凋亡的关系。晚近赵志青等的研究发现，PMN在缺血／再灌注区的聚集量与心肌细胞凋亡的数量成正比，提示PMN参与了细胞凋亡的过程；我室先前的工作也显示PMN在缺血／再灌注引起的心肌细胞凋亡中具有重要的作用。然而到目前为止，关于PMN诱发心肌细胞凋亡的作用尚缺乏可信的直接证据。因此，本项研究旨在采用离体的实验体系，以排除体内复杂因素的干扰，从而探讨PMN与心肌细胞凋亡的直接关系，并在此基础上，进而分析PMN引发心肌细胞凋亡的作用机制。此项研究对进一步阐释缺血／再灌注损伤的机理将具有重要意义。本工作由以下四部分组成： 山冠穿医牙斗口冤学博创匕学位论文2003 一、活化的中性粒细胞对培养乳鼠心肌细胞的致凋亡作用 目的:在体实验的研究结果提示，中性粒细胞可能通过释放氧自由基等物质参与缺血/再灌注诱导的心肌细胞凋亡，但由于在体研究的局限性，尚无直接的证据证明中性粒细胞能直接诱发心肌细胞的凋亡。本项研究的目的是采用离体的实验体系，观察中性粒细胞是否可直接诱导心肌细胞的凋亡。 方法:取新生大鼠(1一3天)的心室肌，进行心肌细胞培养，通过差时贴壁法及阿糖胞昔(10 p mol/L)处理，得到较纯的心室肌细胞，在1%胎牛血清的DMEM培养液中培养24小时后，开始进行实验。该部分设五个实验组，即正常对照组，PAF对照组，三个不同剂量的经PAF活化的PMN处理组(1 05，3火1 05和1 06的P刚分别与3x 106的心肌细胞，共同孵育48小时)，用TUNEL标记，流式细胞分类检测，DNA电泳分析，透射电镜观察等方法，对心肌细胞凋亡进行检测。 结果:(1)新生乳鼠的心室肌细胞与经PAF活化的大鼠中性粒细胞共同孵育48小时后，其TUNEL阳性标记的细胞核的百分比显著增加，而且具有剂量依赖性，三个不同剂量PMN处理组的凋亡细胞百分比分别为24.95士4.65%，39.92士9.43%，69.02士12.55%，均显著高于正常对照组(2.81士0.94%，p(0.01)及PAF对照组(2.80士0.77%，p(0.01)。(见Page 27，Tablel;Page 29，Fig.3.;Page 33，Fig.8.)。(2)流式细胞分类检测得到相似的实验结果，正常对照组及PAF对照组的凋亡细胞百分比分别为2.49士0.50%和2.57士0.56%，而经PMN处理后，三个剂量的PMN组的凋亡细胞百分比分别为22.18士4.70%，36.99士9 .02%和66.34士1 1.43%(p(0.01)(见Page 27，Tablel;Page31，Fig.6.;Page 33，Fig.8)。(3)DNA电泳的实验结果显示，PMN处山冠厅医牙斗大学博d亡学位论文2003理后的心肌细胞可产生明显的DNA梯带，而正常对照组，PAF对照组及培养72小时的心肌细胞则无DNA凋亡梯带的出现(见Page30，Fig.4，Fsg.5.)。(4)透射电镜的观察结果显示，lo6PMN与3xzo6的心肌细胞共同孵一育48小时后，心肌细胞出现凋亡的特征性改变，如细胞核染色质聚集成致密的团块，并沿核膜处凝聚，细胞核出现固缩，细胞核膜凹陷，核裂解成碎块，并有凋亡小体出现。另外，线粒体也有不同程度的损伤(见Page 32，Fig.7.)。 结论:PMN经PAF活化后，可诱导培养乳鼠的心肌细胞发生凋亡。值得注意的是，我们在实验中发现，当PMN未被PAF活化时，并不引起上述的改变。 二、PMN诱导培养乳鼠心肌细胞发生凋亡的可能机制 目的:在上述实验的基础上，我们进一步探讨了PMN诱导心肌细胞凋亡的可能机制。我们首先从PMN在病理条件下，造成组织损伤的基本环节入手，检测了一些炎性因子，氧化应激反应，iNOS蛋白的表达及NO浓度的改变，并测定了细胞内重要的信号物质Caz+浓度的变化，同时我们还检测了PMN对细胞内两个重要的凋亡调节蛋白Bcl一2，Bax表达的影响，借以揭示PMN引发心肌细胞凋亡的可能原因及作用环节。 方法:实验的分组及操作同前，实验结束时，收集培养液，采用放射性免疫测定法检测培养液中儿一6，工L一8及TNF。的浓度，黄嗓吟一黄嗓吟氧化酶法测定Cu一Zn SOD活性，硫巴比妥酸法测定MAD的水平，并应用硝酸盐还原酶法测定培养液中NO的浓度;同时收集心肌细胞，采用western blot分析法观察了iNOS，Bel一2和Bax蛋白表达的变化，另外，还采用荧光影象技术检测了心肌细胞中Caz+浓度的改变。 结果:(l)培养的乳鼠心肌细胞与活化的中性粒细胞共同孵育48山卫穿医科大学仁攀d亡学位喇仑文2003小时后，培养液中的工L一6水平显著增高?