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膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，发病率和复发率高。约95%的膀胱癌为膀胱移行细胞癌（transitional carcinoma cell of the bladder, TCCB）。膀胱镜检是传统的检测方法，但毕竟属于创伤性检查且不能发现早期病变；对TCCB的治疗多采用手术切除结合膀胱内化疗灌注，但化疗毒副作用大，复发率较高。因此，提高患者生存率的有效办法是寻找其无创性、灵敏和特异的早期诊断指标和应用高效、低毒的新型治疗手段。与多数恶性肿瘤类似，TCCB细胞的永生化和染色体末端的端粒和端粒酶密切相关。研究表明，端粒酶（telomerase）是由人端粒RNA（human telomerase RNA，hTR）、端粒相关蛋白1（telomerase related protein 1，TLP1/TP1）和人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）三部分组成，其中hTERT又称端粒酶催化亚基，是端粒酶活性的核心限制因素，对端粒酶的激活起决定作用。除造血祖细胞、精原细胞和卵母细胞表达外，其他正常体细胞中均不表达hTERT。文献报道hTERT与恶性肿瘤的关系较端粒酶与肿瘤的关系更为密切。同时，hTERT在肿瘤细胞内的表达与c-myc相关。肿瘤细胞内hTERT的转录调节受多种因素影响，特别是具有bHLH（basic helix-loop- helix，碱性螺旋-环-螺旋）结构域的c-myc和mad1基因表<WP=19>达产物能和hTERT启动子上的E-box（CACGTG）位点结合，调节hTERT转录。c-myc和mad1基因还通过影响细胞周期等途径介导肿瘤细胞的增殖、分化与凋亡。c-myc基因对细胞生长具有双重性影响，是促进细胞增殖还是促进细胞凋亡，取决于和它共同发挥作用的其他基因性质，当与促细胞增殖的基因共同作用时促进细胞增殖，反之则促进细胞的凋亡或坏死。Mad1蛋白是细胞有丝分裂点的检查蛋白，在细胞由G0期G1期转化时其含量增多，使细胞停滞在G1期而促进细胞分化。目前从其他恶性肿瘤细胞的研究中发现，c-myc和mad1基因对hTERT的转录调节机制可能与以下几方面有关：⑴ c-myc和mad1基因分别激活和抑制TGF-β1基因，激活Smad信号通路而调节hTERT转录；⑵ 增加SID-mSin3A复合物含量，进一步激活细胞内EGF-Ras- MEK1-ERK2信号途径，介导hTERT转录和端粒酶激活；⑶ 与抑癌基因P53共同调节hTERT转录，影响细胞增殖与凋亡；⑷ c-myc和mad1基因对hTERT的调节还需组蛋白去乙酰胺酶复合物（HDAC）参与，与组蛋白的乙酰化和去乙酰化有关；⑸ 组蛋白末端的mSin3和mSin4共阻遏物通过与c-myc和mad1基因结合，影响hTERT启动子构象来调节转录。目前，利用hTERT基因在肿瘤细胞高选择性表达而在多数正常体细胞中不表达的特点，选择hTERT作为恶性肿瘤细胞治疗的靶点。其他研究发现抑制hTERT表达可改变肿瘤的恶性表型，一定程度抑制瘤细胞的增殖。基于国内外研究进展，本研究采用RT-PCR方法，同时检<WP=20>测TCCB细胞株、瘤组织、血单个核细胞、尿脱落细胞内hTERT和c-myc基因的表达；然后构建c-myc基因的真核表达载体pcDNA3.1/c-myc，并利用脂质体转染技术和虫荧光素酶活性检测技术等，探讨pcDNA3.1/c-myc和pcDNA3.1/mad1在TCCB细胞和正常细胞中对不同hTERT启动子的转录调节机制；然后转染pcDNA3.1/mad1、pcDNA3.1/c-myc及pcDNA3.1/mad1和pcDNA3.1/c-myc组合，通过细胞生长曲线、细胞免疫化学、流式细胞分析、半定量RT-PCR等技术观察不同处理在体外对TCCB细胞和正常细胞的生长及相关基因影响；最后利用膀胱癌裸鼠移植瘤模型，应用透射电子显微镜技术、半定量RT-PCR技术和免疫组织化学技术等检测不同作用组对膀胱癌的体内抑制作用。通过以上研究，多层面探讨bHLH家族中c-myc和mad1基因是否以hTERT为靶点，影响TCCB细胞的生长及机制。主要研究结果和结论如下：1．hTERT和c-myc是TCCB无创性的早期诊断指标，两指标的阳性表达率分别为：TCCB细胞株100%和100%，瘤组织100%（28/28）和64.3%（18/28），膀胱癌患者血单个核细胞为78.6%（22/28）和57.1%（16/28），尿脱落细胞为85.7%（24/28）和71.4%（20/28），除血细胞c-myc外，其余均较各自的对照组有显著性差异（P＜0.05），并且两指标在TCCB各标本中的表达呈正相关（P＜0.05）。hTERT较c-myc更特异和灵敏，尤其尿脱落细胞内hTERT表达对TCCB的早期诊断、疗效监测和预后判断有重要价值，建立了无创性检测TCCB的新方法。 <WP=21>2．成功构建了c-myc基因的真核表达载体pcDNA3.1/c-myc，并利用pcDNA3.1/c-myc、pcDNA3.1/mad1、野生型（Tw）和突变型（Td）hTERT启动子的虫荧光素酶报告质粒，证实了膀胱癌T24和EJ细胞中Tw活性显著增强，分别比阴性对照高9.71倍和7.83倍；Td活性比阴性对照高3.45倍和3.05倍。在hTERT表达阳性的COS-7细胞和TCCB细胞中，外源性c-myc能激活Tw转录，其激活作用在0~2.0μg/孔浓度范围内与c-myc剂量成正比；mad1呈剂量依赖性地抑制Tw转录； c-myc和mad1基因对Td的转录调节作用与此相反；正反两方面证实E-box位点是外源性c-myc和mad1调控hTERT启动子转录的重要结构；联合应用c-myc和mad1则抑制Tw转录。同时，在hTERT表达阴性的正常成纤维细胞中，c-myc和mad1对Tw或Td的转录调节作用并不明显。3．采用pcDNA3.