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猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）是引起初孕母猪繁殖障碍性疾病的重要病原,PPV感染母猪临床上主要表现为不发情、流产、产死胎等症状。PPV基因组主要包含两个开放性阅读框（Open reading frame,ORFs）ORF1和ORF2,ORF1编码病毒非结构蛋白NS1和NS2,ORF2编码病毒结构蛋白VP1和VP2。其中NS1是PPV最重要的非结构蛋白,对病毒DNA复制是不可或缺的,在病毒感染过程中主要参与诱导宿主细胞周期阻滞,进而引起细胞病变以及组织损伤。外被体蛋白I（Coater protein complex,COP I）是一种由α、β、β’、γ、δ、ε、ζ亚基组成的七聚体复合物,COP I的生理功能是介导蛋白质由内质网向高尔基体逆向转运,在保持内质网和高尔基体的完整性和维持细胞稳态中发挥重要作用。近年来的研究发现,COP I的不同亚基还参与了病毒的复制过程,COPβ能与肠病毒71型（Enterovirus 71,EV71）2C蛋白相互作用促进EV71的复制;COPε缺失会抑制水疱性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus,VSV）入侵细胞和基因表达从而影响VSV复制。还有研究发现,当COP I亚基COPα发生突变会影响细胞内I型干扰素的产生,进而影响病毒的复制。然而有关宿主蛋白COP I的亚基在PPV复制过程中的作用及机制迄今未见报道。本研究拟在筛选到与NS1发生互作的宿主蛋白COPε基础上,首先构建copε敲除和过表达细胞系,研究COPε对PPV复制的影响。然后,找到NS1与COPε的相互作用氨基酸基序,构建该基序突变的PPV毒株,研究PPV NS1与COPε互作位点突变对PPV自身复制的影响。最后,探讨COPε对细胞IFN-β产生的影响及机制。研究结果为进一步明确PPV的致病机制提供理论依据。研究取得如下结果。1.以表达纯化后的NS1重组蛋白作为诱饵,收集PK-15细胞裂解液与NS1共孵育,以His琼脂糖珠子富集纯化之后切取差异条带进行质谱分析,筛选到与NS1互作的宿主蛋白COPε。将构建好的p GFP-copε转染至PK-15细胞,激光共聚焦结果显示,COPε主要定位于细胞质。将p CDNA-HA-copε和p CI-Flag-ns1共转染于HEK293T,分别用Flag和HA单克隆抗体富集NS1与COPε,Co-IP结果显示,NS1与COPε存在相互作用;激光共聚焦结果显示,NS1与COP在PK-15细胞核中存在明显共定位。用带有His标签的D-PPV感染PK-15细胞,利用His单克隆抗体富集细胞内源性COPε;Co-IP结果显示,NS1能与内源性COPε发生相互作用;激光共聚焦结果显示,D-PPV感染PK-15细胞后NS1与COPε在细胞核中存在明显共定位。2.copεsi RNA预处理PK-15细胞12 h后感染1 MOI PPV,荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,感染后12 h和24 h si RNA组的病毒基因组拷贝数均显著降低（P<0.05）。构建了copε敲除细胞系PK-15copε-/-,1 MOI PPV感染PK-15copε-/-和野生型PK-15,24 h后检测细胞上清病毒基因组拷贝数和TCID50,结果发现与对照组相比,PK-15copε-/-上清病毒基因组拷贝数和TCID50均显著降低（P<0.05）,同时,PPV NS1的表达也显著降低（P<0.05）。构建copε过表达细胞系PK-15COPε,1 MOI PPV感染PK-15COPε24 h后,检测细胞上清病毒基因组拷贝数和TCID50,结果显示与对照组比较,PK-15COPε上清病毒基因组拷贝数和TCID50显著升高（P<0.05）,同时,PPV NS1的表达也显著升高（P<0.05）。3.将p CDNA-HA-copε分别与p GFP-ns1（1-86 aa）和p GFP-ns1（87-662 aa）共转染至HEK293T后Co-IP结果显示,COPε与NS1（1-86 aa）存在相互作用;激光共聚焦结果也显示COPε与NS1（1-86 aa）在细胞核存在明显的共定位。将p CDNA-HA-copε分别和构建的突变载体p GFP-ns1ΔS1（25-31 aa）与p GFP-ns1ΔS2（36-42 aa）共转染至HEK293T,Co-IP结果显示COPε与NS1缺失N端25 aa～31 aa不能发生相互作用,激光共聚焦结果也显示COPε与NS1缺失N端25 aa～31 aa在PK-15细胞中不存在共定位。以上结果表明,NS1与COPε相互作用位点位于NS1 N端25 aa～31 aa。构建NS1N端25 aa～31 aa突变的感染性克隆质粒p PPVNC-,p PPVNC-转染PK-15细胞,连续盲传5代进行病毒拯救,拯救成功的病毒命名为PPVNC-。分别用1 MOI的PPV与PPVNC-感染PK-15细胞,荧光定量PCR结果显示,在感染24 h后PPVNC-组病毒基因组拷贝数显著高于PPV感染组（P<0.05）。4.1 MOI PPV感染PK-15copε-/-和野生型PK-15细胞8 h后,检测IFN-βm RNA水平,结果显示,与野生型PK-15细胞相比,PK-15copε-/-中IFN-βm RNA表达水平显著升高（P<0.05）。1 MOI PPV感染PK-15copε-/-和野生型PK-15细胞24 h后,western blotting检测TBK1、IRF3及其磷酸化水平,结果显示与野生型PK-15细胞相比,PK-15copε-/-中TBK1、IRF3无明显变化（P>0.05）,而p-TBK1、p-IRF3表达水平显著升高（P<0.05）。1 MOI PPV和PPVNC-感染野生型PK-15细胞8 h后,荧光定量PCR检测结果显示与野生毒株感染细胞相比,PPVNC-感染细胞IFN-βm RNA表达水平显著降低（P<0.05）。1MOI PPV和PPVNC-感染野生型PK-15细胞24 h后,western blotting结果显示与野生毒株感染组相比,PPVNC-组细胞内TBK1、IRF3无明显变化（P>0.05）,而p-TBK1、p-IRF3表达水平显著降低（P<0.05）。本研究成功筛选到与NS1发生互作的宿主蛋白COPε,干扰、敲除和过表达copε的细胞试验结果表明,COPε对PPV的复制有明显的影响。确定了NS1与COPε相互作用位点位于NS1 N端25 aa～31 aa,构建了该互作位点突变的PPV突变毒株并命名为PPVNC-,发现了PPVNC-感染对病毒自身复制有明显的影响。证实了COPε通过影响TBK1、IRF3磷酸化水平调控IFN-β的表达,进而影响PPV的复制。研究结果为进一步探索PPV致病机制提供理论依据。