TLR (Toll like receptor)是固有免疫分子中模式识别受体家族的一员。近来的研究表示TLRs不仅在固有免疫细胞上表达,在适应性免疫细胞表面,如各亚群的T细胞表面也同样表达,并且T细胞表面的TLRs受其相应配体刺激后可影响T细胞的功能发挥。如在利氏曼原虫感染诱发的自身免疫性肠炎动物模型中,TLR2激动剂BLP可增强CD4+CD25-效应T细胞的增殖及细胞因子的分泌,下调调节性T细胞的增殖抑制功能,从而加重自身免疫病的病情。TLR2激动剂对自身免疫病模型中免疫状态的调节作用启发我们TLR2激动剂是否可以调节肿瘤模型中的T细胞免疫功能,从而影响机体的抗肿瘤免疫应答。基于上述设想,我们首先检测了3LL肺癌荷瘤小鼠T淋巴细胞表面TLRs的表达,在明确T细胞表达TLR2的基础上,以其配体BLP作用于荷瘤小鼠,通过受配体作用刺激机体免疫细胞,尤其是T细胞的应答,观察抗肿瘤效应。进一步,通过对T细胞亚群的免疫格局及免疫功能分析,探讨BLP的免疫作用机制,为BLP作为免疫增强剂应用于肿瘤生物治疗提供理论及实验依据。第一部分TLR2激动剂BLP的抗肿瘤效应3LL肿瘤细胞株是小鼠非小细胞性肺癌来源的肿瘤细胞系。为验证TLR2激动剂BLP是否具有抑制肿瘤生长的特性,我们在C57BL/6小鼠右侧腹股沟皮下接种3LL肿瘤,实验组自肿瘤接种后,每五天每只小鼠腹腔注射BLP 50μg,共注射5次。对照组注射PBS。期间每隔2-3天,测量肿瘤生长大小,并观察小鼠生存率,当肿瘤面积超过144mm2后,处死小鼠。结果显示,BLP处理组小鼠可完全抑制肿瘤在体内的生长,并且使小鼠获得100%的生存率,而对照组小鼠肿瘤则持续生长至被处死。表明BLP具有抗肿瘤效应。为了解BLP的抗肿瘤效应是通过直接作用于肿瘤细胞,还是通过宿主的免疫系统发挥作用,我们首先通过FACS的方法证实3LL肿瘤细胞上表达TLR2,接着在体外以不同浓度BLP (0,0.5,1,2,4μg/ml)作用于肿瘤细胞进行观察。结果显示BLP体外处理3LL肿瘤细胞后,肿瘤细胞的增殖及凋亡未发生明显改变,其分泌TNF-α及IL-6的能力未受影响。进一步,将3LL肿瘤细胞接种至T细胞免疫缺陷的裸鼠体内,结果显示,BLP对裸鼠体内3LL肿瘤的生长无影响。表明BLP发挥的抗肿瘤作用不是通过直接作用于肿瘤细胞产生的,提示可能是通过作用于宿主的免疫系统发挥效应。第二部分TLR2激动剂BLP诱导增强的抗肿瘤特异性免疫应答通过第一部分体内外的实验证实TLR2激动剂BLP不改变3LL肿瘤细胞本身生物学特性,排除了TLR2激动剂BLP直接作用于肿瘤细胞的可能。在本部分中,我们着重研究BLP对免疫系统的影响。首先,以BLP体外处理正常小鼠脾脏淋巴细胞,发现CD3+T细胞比例较未处理组显著提高,其中以CD3+CD8+T细胞亚群比例改变更为显著,而B, NK, DC细胞比例变化不明显,表明BLP主要改变了T细胞亚群的比例。随后我们采用FACS的方法检测了各亚群T细胞表面TLR2的表达情况。结果显示经CD3/CD28单克隆抗体活化后,CD4+CD25-Teff、CD4+CD25+Treg及CD8+CTL细胞表面均检测到了TLR2的表达,其中CD4+CD25-Teff上TLR2的表达较Treg及CTL高。与未经BLP处理的对照组比较,CD4+CD25-Teff的体外增殖能力显著增强,细胞因子IFN-y的分泌明显提高(3.215±0.063μg/ml vs 0.6538±0.005μg/ml),而IL-4的表达水平则显著下降(19.24±1.552pg/ml vs 40.08±2.439pg/ml),表明BLP体外处理Teff后,上调了其增殖能力,并呈现出Th1型细胞免疫应答格局。同样,BLP体外处理CTL后,其效应分子IFN-y及Greanzyme B均较对照组显著增强。上述结果表明BLP确实可以通过直接于T细胞表面的TLR2作用,改变T细胞的功能。进一步,我们研究BLP对荷瘤小鼠T淋巴细胞的影响。结果显示,荷瘤小鼠来源的Teff经BLP体外处理后,获得了与正常脾脏淋巴细胞经BLP处理后相同的效果。体现为：增殖能力明显提高,细胞因子IFN-y的分泌水平显著上升,而IL-4的表达水平显著下降,呈现出Th1型细胞免疫应答格局。BLP体外处理CTL后,其增殖能力增强,效应分子IFN-y及Greanzyme B的表达均显著上调,提示CTL效应的增强。在上述体外研究基础上,我们对BLP治疗有效的荷瘤小鼠的免疫功能进行了深入的研究。应用CFSE标记的增殖检测方法,我们将治疗有效的小鼠脾脏淋巴细胞体外经5μM CFSE标记后,与丝裂霉素C灭活的3LL肿瘤细胞按10：1的比例,在含50U/ml IL-2的培养基中共孵育7天。FACS检测淋巴细胞增殖,结果显示BLP体内治疗后,肿瘤致敏的淋巴细胞针对肿瘤抗原的特异性增殖显著提高。进一步我们在体外检测了经BLP治疗后小鼠CTL的杀伤功能,应用上述同样的方法获取肿瘤特异性CTL细胞(效应细胞)。CFSE标记对数生长期的3LL肿瘤细胞,作为靶细胞。按不同效靶比(100：1,50：1,25：1,5：1)将效应细胞与靶细胞混合置于圆底96孔板中,共孵育4小时后终止反应。反应结束后,每孔中加入1μl的PI染液,并迅速FACS检测CFSE阳性靶细胞的死亡率,从而反映CTL的杀伤能力。结果显示在效靶比为100：1的情况下,PI阳性的靶细胞比例由对照组的15.38±0.62%上升到41.90±0.905%,说明经BLP治疗后小鼠CTL的杀伤功显著增强。综上所述,无论正常小鼠还是荷瘤小鼠来源的T细胞,体外BLP处理均可增强CD4+CD25-Teff细胞的增殖,并诱导细胞因子分泌类型偏向Th1型；同时BLP处理后还增强了CTL增殖能力、效应分子表达及肿瘤特异性CTL的增殖和杀伤,从而使机体产生增强的抗肿瘤特异性免疫应答。第三部分TLR2激动剂BLP增强抗肿瘤免疫效应的可能机制上述实验结果证实,TLR2激动剂BLP诱导了增强的抗肿瘤免疫应答,在这部分中我们将通过检测体内CD4+CD25+Treg细胞的功能、体内CTL特异性杀伤能力、及特异性免疫记忆产生等方面,对BLP增强抗肿瘤免疫记忆的机制进行初步的探讨。CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞在肿瘤免疫耐受中发挥关键作用,TLR2激动剂BLP处理后是否改变了Treg的功能?我们采用MACS分选的方法从正常或荷瘤小鼠体内脾脏淋巴细胞分选获得CD4+CD25+Treg细胞,体外经CD3/CD28活化并加入终浓度为5μg/ml的BLP处理,72小时后将Treg与CFSE标记的相应Teff细胞共孵育,CD3/CD28活化,FACS检测Teff的增殖,以新鲜分选获得的Treg与CFSE标记的Teff共孵育后作为对照。结果显示BLP处理后,正常或荷瘤小鼠Treg的增殖抑制功能均明显下调。为验证CTL的体内杀伤功能,分别以高、低浓度的荧光分子CFSE标记3LL靶抗原以及对照细胞,将两群细胞等比混合后经尾静脉分别接种于荷瘤小鼠或经BLP体内处理的荷瘤小鼠体内,通过FACS分析两群CFSE阳性细胞在体内的比例变化,反应小鼠体内肿瘤特异性CTL的杀伤能力。结果表明,只有在经BLP治疗的荷瘤小鼠体内,其CTL发挥了显著的杀伤靶细胞功能,而未经BLP治疗的荷瘤小鼠没有产生有效的CTL效应。最后,我们选择经BLP治疗有效,并存活超过100天的小鼠。再次将5×1043LL肿瘤细胞接种到小鼠左侧腹股沟,并于右侧腹股沟接种1×106的FBL3无关肿瘤细胞,对照组为正常小鼠。结果显示,BLP治疗有效的小鼠,可完全抵御第二次3LL肿瘤细胞的攻击,正常小鼠组肿瘤持续生长。但FBL3在两组小鼠中均成瘤,并持续生长,两组无显著性差异。说明BLP治疗后,小鼠获得了针对3LL肿瘤的免疫记忆。综上所述,TLR2激动剂BLP诱导增强的抗肿瘤免疫应答的机制可能与Treg增殖抑制功能的下调、CTL体内杀伤能力提高和肿瘤免疫记忆产生相关。