背景:2型糖尿病是由多种病因引起的代谢紊乱疾病,其特征为慢性高血糖。虽然目前的研究并未完全阐明2型糖尿病的发病机制,但公认的两个重要环节是胰岛素抵抗和β细胞分泌功能不全,其中贯穿于2型糖尿病的整个发生发展过程的是胰岛素抵抗。据近些年的研究结果,在2型糖尿病胰岛素抵抗中发挥重要作用的是炎症反应和脂代谢紊乱。单纯地降糖或调脂不再是糖尿病治疗的终级目标,针对以糖、脂为代表的级联反应问题进行综合调节才是首要之务。西药的终级目标多为单一机制的调节,较易发生降糖和增加体重(如胰岛素增敏剂)同时出现的现象,除调脂以外,还会引发肝功能损害等弊端。本论文通过实验研究、文献综述、理论探讨等方法,对中药苦酸通调法、连梅汤加味防治2型糖尿病和脂代谢紊乱进行系统地研究。肥胖和炎症、脂代谢紊乱以及2型糖尿病胰岛素抵抗的关系:肥胖与2型糖尿病及胰岛素抵抗有着密切联系,尤其是中心型肥胖。肥胖是2型糖尿病患者普遍存在的问题,根据近年流行病学调查结果,85%-90%的2型糖尿病患者为超重或肥胖。肥胖与慢性炎症密切相关,脂肪组织是肥胖引起慢性炎症反应的主要起始部位,尤其是内脏脂肪组织在产生和调节炎症反应方面起了非常重要的作用。胰岛素信号转导产生的胰岛素抵抗,被脂肪细胞分泌的多种炎性细胞因子所阻碍,进而引发2型糖尿病的发生。由此可见,肥胖与炎症、脂代谢紊乱、以及2型糖尿病胰岛素抵抗均有密切的关系。所以为了更为有效地预防和治疗肥胖2型糖尿病,需要明确肥胖、炎症、脂代谢紊乱和胰岛素抵抗之间的作用机制。我们在前期工作中已经初步证实了炎症、脂代谢在肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病的发病中起到的重要作用,但是尚未将炎症、脂代谢与糖尿病胰岛素抵抗联系起来。SREBPs是一类位于内质网上的膜连接蛋白,是一种核转录因子,SREBPs在内质网合成后与SREBP裂解激活蛋白(SCAP)结合,并由其送到高尔基体,在高尔基体分别被位点1蛋白酶和位点2蛋白酶依次加工,最后释放出其氨基末端片段,该片段进入细胞核内与其靶基因启动子的固醇调节元件结合,调节相关基因的表达。SREBP-1c在脂代谢紊乱发展过程即脂质不断积聚的过程中发挥重要作用。SREBP-1c又称脂肪细胞定向和分化因子1,主要在啮齿类动物和人类的肝脏和脂肪细胞表达,参与调控脂肪酸、甘油三酯的合成以及糖代谢相关酶基因的表达。SREBP-1c在脂肪组织特异性高表达,使肝脏对胰岛素发挥作用蛋白的合成受到限制,从而使胰岛素作用下降,造成胰岛素抵抗和高胰岛素血症;另外,脂质积聚过程又是成熟脂肪细胞体积增大的过程,与脂质合成(甘油三酯、脂肪酸合成)相关的基因表达相关。受SREBP-1c调控的FAS在脂肪酸合成中起重要作用。游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)作为脂肪代谢的中间产物,它的增多可以降低胰岛素的敏感性,从而导致或加重胰岛素抵抗。因此,通过防止和逆转SREBP-1c的表达,可能是一条有效防治2型糖尿病及其并发症的途径。实验一苦酸通调方对实验性糖尿病大鼠的糖、脂代谢等影响目的:糖尿病以高血糖为特征,同时还合并有脂代谢紊乱,血糖与血脂相互影响。因此,治疗上在积极有效地调节糖尿病患者的血糖的同时,应注意调节脂代谢紊乱。实验一为本课题的基础研究,通过对实验性大鼠的一般状态、血糖、血脂、胰岛素水平等检测,以探讨苦酸通调方对糖尿病大鼠糖脂代谢的影响。方法:1实验性动物模型的制作将42只ZDF大鼠以及10只ZL大鼠分笼饲养,每笼2只,自由摄食、饮水。各组予普通饲料适应性喂养1周后,ZL组继续给予普通饲料喂养,ZDF组给予高脂饲料喂养。至12周时,共成糖尿病模型ZDF大鼠30只。2.判断糖尿病大鼠造模成功的标准大鼠定期行糖耐量实验,试验前禁食不禁水15h,剪尾取血微量血糖仪测空腹血糖后,予30%葡萄糖溶液按2g/kg灌胃。糖负荷后分别在0.5h、1h、1.5h和2h剪尾取血,用血糖仪测量血糖。当血糖峰值高于16.7mmol/L,和糖负荷后2h高于11.1mmol/L时,可诊断为糖尿病。如具备上述任意一条时,为糖耐量减低。取诊断为糖尿病或者糖耐量减低的大鼠为实验对象。3.实验动物分组及给药方法将造模成功的ZDF大鼠30只随机分为模型组(n=10),苦酸通调组(n=10)、吡格列酮组(n=10)3组,10只ZL大鼠为空白对照组。将苦酸通调方和吡格列酮分别配置成混悬液,造模成功后,苦酸通调方使用时按照3.29g/kg/d体重(前期工作已确定的最佳剂量)混悬液灌胃,吡格列酮组按照1.07mg/kg/d体重灌胃,空白对照组和模型组均予等体积蒸馏水灌胃,各组大鼠均连续灌胃12周,每日1次。用药治疗期间空白对照组大鼠饲以普通饲料,其他组饲以高脂饲料。结果:1一般情况在喂养期间,ZL组大鼠均较活跃,对抓取抵抗明显,正常进食饮水,毛色亮泽。ZDF大鼠较ZL大鼠肥胖,体重增长迅速,活动迟缓、反应有钝,毛色干枯而无光泽,各组均无死亡。2体重变化治疗前后各组大鼠体重变化如表1所示。经药物治疗后,模型组、苦酸通调组、吡格列酮组体重均显著高于空白对照组(P<0.01)。治疗4周后,各治疗组体重与模型组相比,虽有下降趋势,但无统计学意义(P>0.05)。治疗12周后,治疗组大鼠体重与模型组相比明显下降(P<0.01),苦酸通调组大鼠体重与模型组相比明显下降(P<0.05),吡格列酮组大鼠体重与模型组相比虽有下降,但无显著差异(P>0.05)。3血糖情况3.1大鼠OGTT血糖的变化治疗12周后,与正常对照组相比,模型组、吡格列酮组、苦酸通调组空腹血糖明显升高,有显著差异性(P<0.01)。治疗组大鼠血糖较模型组明显降低(P<0.05,P<0.01),苦酸通调组血糖与吡格列酮相比有显著性差异(P<0.01)。3.2血清胰岛素(INS)大鼠在34周龄时(即治疗12周后),与正常对照组相比,模型组血清胰岛素水平明显升高(均P<0.01)。与模型组相比,吡格列酮组、苦酸通调组血清胰岛素有不同程度的降低,均有显著性差别(P<0.01),但苦酸通调组与吡格列酮组相比无显著性差异(P>0.05)。3.3糖化血红蛋白(Hb A1C)大鼠在34周龄时(即治疗12周后),与正常对照组相比,模型组大鼠糖化血红蛋白明显升高,有显著差异(P<0.01)。与模型组相比,吡格列酮组、苦酸通调组Hb A1C下降明显(P<0.01),且苦酸通调组优于吡格列酮组。4血脂治疗12周后检测结果显示,与正常组相比,模型组血清TG、TC、FFA水平均明显升高(P<0.01)。与模型组相比,吡格列酮组、苦酸通调组TG、TC、FFA明显降低(P<0.05,P<0.01)。苦酸通调组与吡格列酮组比较,降低TG、TC、FFA水平有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。表明苦酸通调方可以降低实验性糖尿病大鼠血清TC、TG、FFA水平,有调节脂代谢的作用。结论:1、苦酸通调方能显著降低ZDF大鼠的血糖、糖化血红蛋白水平及血清胰岛素水平,提示苦酸通调方能增加胰岛素敏感性,改善胰岛素抵抗。2、苦酸通调方能显著降低ZDF大鼠的TG、TC以及FFA水平,提示苦酸通调方具有较好的调节脂代谢紊乱的作用。实验二苦酸通调方对实验性糖尿病大鼠脂肪组织中Fas m RNA表达的影响目的:观察苦酸通调方对实验性糖尿病大鼠腹腔脂肪组织FAS m RNA表达的情况,探讨苦酸通调方治疗2型糖尿病的新的靶点。方法:1分组及给药(同实验一)2标本采集各组大鼠在治疗第12周末灌胃结束后,禁食不禁水12h,将大鼠乙醚麻醉,打开腹腔,快速提取腹腔脂肪组织,分装后迅速放入液氨罐,移至-80℃冰箱里冻存待用。3 RT-PCR法检测各组大鼠脂肪组织Fas m RNA的表达3.1大鼠腹部脂肪组织总RNA的提取3.2 RNA纯度的测定用Trizol法提取脂肪组织总RNA后,用紫外分光光度计测定260nm、280nm的紫外吸收值,重复三次。如各组结果A260/A280在1.8-2.0之间,说明提取的RNA纯度较高。3.3 RNA反转录反应(1)取0.2ml EP管,分别加入以下试剂,完成RT反应液的配置(2)将上述试剂混匀静置10分钟,上PCR仪反应(45℃水浴40min,95°水浴5min,5℃水浴5min)灭活逆转录酶后,存放于-20℃冰箱中备用。3.4 RT-PCR反应3.4.1引物序列(见表6)3.4.2反应条件(1)GAPDH反应条件(2)Fas反应条件3.5 PCR产物的检测和分析结果:各组大鼠脂肪组织Fas m RNA的表达经RT-PCR法检测各组大鼠腹部脂肪组织中Fas m RNA的表达水平。结果显示,在治疗第12周末,模型组、吡格列酮组、苦酸通调组大鼠腹腔脂肪组织中Fasm RNA的表达与明显高于空白对照组(P<0.01)。苦酸通调组和吡格列酮组与模型组相比均明显降低(P<0.01,P<0.05),说明苦酸通调方和吡格列酮降低糖尿病大鼠腹腔脂肪组织Fas基因表达的作用。苦酸通调组优于吡格列酮组(P<0.05)。结果见图1。结论:ZDF大鼠脂肪组织Fas m RNA的表达量显著上调,经苦酸通调方治疗后的大鼠脂肪组织Fas m RNA表达量明显降低,提示苦酸通调方能够抑制Fas的表达,考虑抑制Fas表达可能是苦酸通调方调节脂代谢的作用机制之一。实验三苦酸通调方对实验性糖尿病大鼠脂肪组织中SCAP、SREBP-1c m RNA和蛋白表达的影响目的:观察苦酸通调方对实验性糖尿病大鼠腹腔脂肪组织SCAP、SREBP-1cm RNA和蛋白的表达的情况,探讨苦酸通调方治疗2型糖尿病的新的靶点。方法:1.分组及给药(同实验一)2.标本采集各组大鼠在治疗第12周末灌胃结束后,禁食不禁水12h,将大鼠乙醚麻醉,打开腹腔,快速提取腹腔脂肪组织,分装后迅速放入液氨罐,移至-80℃冰箱里冻存待用。3.RT-PCR法检测各组大鼠脂肪组织SCAPm RNA、SREBP-1c m RNA的表达3.1大鼠腹腔脂肪组织总RNA的提取3.2 RNA纯度的测定3.3 RNA反转录反应3.4 RT-PCR反应3.4.1反应条件3.5 PCR产物的检测和分析4 Western-blot法检测各组大鼠脂肪组织SCAPm RNA、SREBP-1c蛋白的表达4.1收集蛋白样品4.2电泳4.2.1 SDS-PAGE凝胶配制4.2.2转膜4.2.3封闭4.2.4杂交结果:1.各组大鼠脂肪组织SCAP、SREBP-1c蛋白的表达经Western blot法检测各组大鼠脂肪组织中SCAP、SREBP-1c蛋白的表达水平。结果显示,在治疗第12周末,与空白对照组相比,模型组、吡格列酮组、苦酸通调组大鼠脂肪组织中SCAP、SREBP-1c蛋白的表达水平明显升高(P<0.01)。苦酸通调组和吡格列酮组与模型组相比均明显降低(P<0.01,P<0.05),说明苦酸通调方和吡格列酮降低糖尿病大鼠脂肪组织SCAP、SREBP-1c蛋白的表达水平。苦酸通调组优于吡格列酮组(P<0.05)。结果见图2。2.各组大鼠脂肪组织SCAP、SREBP-1c m RNA的表达经RT-PCR法检测各组大鼠腹部脂肪组织中SCAP、SREBP-1c m RNA的表达水平。结果显示,在治疗第12周末,模型组、吡格列酮组、苦酸通调组大鼠腹腔脂肪组织中SCAP、SREBP-1c m RNA的表达与明显高于正常对照组(P<0.01)。苦酸通调组和吡格列酮组与模型组相比均明显降低(P<0.01,P<0.05),说明苦酸通调方和吡格列酮降低糖尿病大鼠腹腔脂肪组织SCAP、SREBP-1c基因表达的作用。苦酸通调组优于吡格列酮组(P<0.05)。结果见图3。结论:ZDF大鼠脂肪组织SCAP、SREBP-1c蛋白的表达量显著上调,经苦酸通调方治疗后的大鼠脂肪组织SCAP、SREBP-1c蛋白的表达量明显降低,提示苦酸通调方能够抑制SCAP与SREBP-1c相结合,提示抑制SCAP/SREBP通路的基因及蛋白的表达可能是该中药复方的作用途径之一。