随着人类生存环境和生活习性的改变,在一些不利的外部环境作用下,肿瘤的发病率正在逐步上升,已经成为严重威胁人类健康的常见疾病。肝癌是世界各地成人中常见的高死亡率的原发性肿瘤之一。化疗是目前临床上治疗肝癌最常见的、有效的策略。天然药物在癌症的化疗中扮演着非常重要的角色。特勒内酯是从金挖耳中提取的一种桉烷内酯类化合物。金挖耳是一种中草药具有其解热,镇痛和抗炎、杀菌的作用。有研究报道,特勒内酯对多种人类的肿瘤细胞具有强烈的细胞毒性。我们首先用MTT法筛选了几种金挖耳提取物,对肿瘤细胞株Smmc-7721, HepG-2, LX-2, A549, U87以及正常细胞HL-7702的生长抑制作用,结果显示特勒内酯具有最强细胞毒性,而对正常细胞株HL-7702的细胞毒性与肿瘤细胞相比显著降低,表明肿瘤细胞对特勒内酯更为敏感。我们筛选出抑制增殖作用尤为显著的肝癌细胞进行作用机理的初步探讨。接着通过DAPI染色,荧光显微镜观察及Annexin V/PI双染后流式细胞仪检测细胞凋亡,我们可以看到特勒内酯诱导的肝癌细胞死亡过程中会出现染色质浓缩,凋亡小体形成,磷脂酰丝氨酸暴露在细胞膜外表面等现象。这些现象说明,特勒内酯是通过凋亡的方式诱导肝癌细胞死亡。流式细胞仪分析结果表明特勒内酯会诱导肝癌细胞线粒体膜电势降低,细胞内自由的钙离子浓度升高,活性氧水平增加。除此之外,Western Blot实验表明,特勒内酯会降低肝癌细胞中Apaf-1和Bcl-2的表达,增加Bax的表达,诱导细胞色素C从线粒体中释放,活化caspase-9和caspase-3引发了caspase的级联反应,最终导致细胞凋亡。这些结果表明特勒内酯是通过线粒体介导的凋亡通路来诱导肝癌细胞凋亡。为开发新型治疗肝癌的药物,特勒内酯值得进一步的深入研究。后来我们的实验进一步发现特勒内酯在诱导肝癌细胞凋亡之前会阻滞细胞周期进程。我们的数据表明特勒内酯诱导ROS的产生会导致p38MAPK的磷酸化。很多研究表明,p38MAPK不仅参与炎症反应,而且在应激反应的信号转导、细胞增殖、细胞周期阻滞及凋亡中都发挥着重要作用。据报道,p38MAPK可以通过控制Cdc25的磷酸化来介导细胞G2/M期阻滞。流式细胞仪分析显示特勒内酯诱导肝癌细胞G2/M期阻滞成浓度和时间依赖性。用特勒内酯处理HepG-2细胞24h后,对照组细胞G2/M期分布占8.37%,15μmol/L特勒内酯G2/M期所占50.88%。Western Blot结果显示特勒内酯显著地了增加了phospho-p38, phospho-MAPKAPK-2, phospho-Cdc25A和phospho-Cdc2的表达,降低了Cdc-25, Cdc-2和Cyclin B1蛋白的表达。同时,p38MAPK抑制剂SB203580(2.5μmol/L)可以显著的降低特勒内酯诱导产生的G2/M期阻滞,并提高细胞的存活率。当HepG-2细胞用SB203580(5μmol/L)预处理1h后,细胞在15μmol/L特勒内酯48h的存活率由原来31.67%提高到61.8%,G2/M期细胞由原来的50.88%下降到17.17%。这些结果表明p38MAPK信号通路介导了特勒内酯引起的HepG-2细胞周期阻滞。以上研究表明特勒内酯是通过两种分子信号通路共同诱导肝癌细胞凋亡。特勒内酯在活化线粒体信号通路的同时,开启了p38MAPA信号通路介导的细胞G2/M期阻滞,协同诱导肝癌细胞凋亡。本实验说明特勒内酯是一种具有潜在开发价值的抗癌先导物,值得更进一步的研究。