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乙酸酯是清香型白酒的主体香气成分,是白酒重要的风味物质之一,不同香型白酒中的乙酸酯含量具有一定的差异性。为满足不同香型白酒对乙酸酯含量的不同要求,选育一系列不同乙酸酯生成能力的酿酒酵母菌株,对提高白酒的品质具有重要意义。在代谢工程中,启动子文库是调控目的基因精确表达的重要调控策略。因此,本研究通过构建PGK启动子突变文库,对醇乙酰基转移酶编码基因ATF1的表达进行精确调控,最终构建出具有不同产乙酸酯能力的酿酒酵母重组菌株。主要研究内容如下:(1)通过易错PCR获得一系列突变PGK启动子,以增强型绿色荧光蛋白EGFP为报告基因,检测突变PGKp的强度,构建了含有28个PGK突变子的PGK突变文库。PGKp突变文库的强度范围在野生型PGKp的10%至141%之间。利用β-半乳糖苷酶lacZ基因作为第二报告基因,检测了 8、17、18、22、25、27、28号PGK突变启动子的强度,证实了 EGFP作为第一报告基因的准确性,同时确定了 7个PGKp突变子的强度依次为:8<17<18<22<野生型<25<27<28。(2)将8、17、18、22、25、27、28号PGK突变启动子进行测序,确定了突变位点,同时将这7个PGKp整合到pUC-19载体质粒上进行启动子的保存。通过生物信息学方法确定了 PGKp的上游激活序列和部分突变转录调控元件(TATA-Box、Gcr1p、Rap1p、Abf1p、Reb1p)的具体位置。位于启动子的元件上的碱基突变可能是启动子强度变化的原因之一。(3)利用8、17、18、22、25、27、28号PGK突变启动子和野生型PGKp,构建敲除BAT2基因并过表达ATF1基因的酿酒酵母突变株a45-A8、a45-A17、a45-A18、a45-A22、a45-A25、a45-A27、a45-A28和a45-AWT,发酵所得的蒸馏酒样中乙酸乙酯的产量分别为 18.64 mg/L、34.67 mg/L、118.88 mg/L、179.57 mg/L、254.64 mg/L、146.73 mg/L、270.24 mg/L、305.68 mg/L。测定了 ATF1基因的 mRNA 水平及醇乙酰基转移酶(AATase)的酶活力。结果显示,不同强度的PCK启动子可以精确调控ATF1的表达和乙酸酯的生成。研究表明,PGK启动子突变文库的强度变化范围较广,有着良好的应用前景。利用文库中的PGKp构建的重组菌株能够生成不同梯度含量的乙酸酯,从转录水平和酶活水平验证了突变PGKp对ATF1基因的精确调控能力。这些重组菌株能够满足不同风格、品牌白酒对不同含量乙酸酯的要求,达到了改善白酒风味和品质的目的。