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赭曲霉毒素是一类真菌次生代谢物,主要由曲霉菌属和青霉菌属的某些种产生,其中赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)毒素强,污染广,一旦污染了农产品则很难降解去除。因此,开发具有高灵敏度的检测方法显得尤为重要。近年来,核酸扩增技术拓展应用于真菌毒素检测,并被认为是推动真菌毒素与食源性致病菌同步检测的重要平台。然而,因为真菌毒素是小分子化合物无法直接扩增,所以使得真菌毒素的核酸扩增技术一直难以突破。针对上述难题,本研究以OTA为研究对象,采用实验室前期成功研制出OTA抗独特型纳米抗体噬菌体(phage VHH 2-21)作为研究材料,利用噬菌体展示抗体同时具备抗体和对应DNA的特点,研究探讨并建立了农产品OTA的三种核酸扩增检测方法。本研究具体内容和创新点如下:1.研究建立了农产品OTA的基于SYBR GreenⅠ荧光染料的实时免疫PCR检测方法。本研究以phage VHH 2-21为研究材料,通过棋盘法得出了该批次噬菌体展示抗独特型纳米抗体和作包被抗原的最佳免疫工作浓度。针对噬菌体中该抗独特型纳米抗体的核酸序列设计特异性引物,通过后续的扩增得到的熔解曲线和扩增效率证明其正确性。使用标准浓度的phage VHH2-21,从引物浓度和退火温度两个方面优化基于SYBR GreenⅠ荧光染料的实时免疫PCR扩增条件。采用梯度稀释的phage VHH 2-21,在优化得到的条件下进行实时免疫PCR,根据计算得到的扩增效率验证优化得到条件正确性并再次确认引物设计的合理性。采用上述的最优条件,建立了农产品OTA基于SYBR GreenⅠ荧光染料的实时免疫PCR检测方法的标准曲线,其灵敏度为0.03ng/mL,检测限为0.003 ng/mL。采用玉米、大米和小麦三种基质对基于SYBR GreenⅠ荧光染料的实时免疫PCR检测方法进行基质效应评价,得出经过添加BSA或用石油醚脱脂处理后的基质对该方法的影响不显著。采用2 ng/mL、5 ng/mL和10 ng/mL三个梯度赭曲霉毒素A标准品进行添加回收分析,得到该方法的加标回收率为88.7%-113.4%,符合回收率要求(80%-120%)。因此本研究中建立的基于SYBR GreenⅠ荧光染料的实时免疫PCR检测方法适用于农产品产品中OTA的检测。2.研究建立了农产品OTA的基于Taqman探针的实时免疫PCR检测方法。本研究以phage VHH 2-21为研究材料,针对噬菌体中该抗独特型纳米抗体的核酸序列设计特异性引物和Taqman探针,通过后续的扩增效率证明其正确性。使用标准浓度的phage VHH 2-21,从引物浓度、探针浓度和退火温度三个方面优化基于Taqman探针的实时免疫PCR扩增条件。采用梯度稀释的phage VHH 2-21,在优化得到的条件下进行实时免疫PCR,根据计算得到的扩增效率验证优化得到条件正确性并确认引物设计的合理性。采用上述优化的phage VHH 2-21和包被抗原的最佳免疫工作浓度和Taqman探针的实时免疫PCR最佳扩增条件建立标准曲线,得到其灵敏度为0.012 ng/mL,检测限为0.001 ng/mL。采用玉米、大米和小麦三种基质对基于Taqman探针的实时免疫PCR检测方法进行基质效应评价,得出经过添加BSA或用石油醚脱脂处理后的基质对该方法的影响不显著。采用2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL,三个梯度赭曲霉毒素A标准品进行添加回收分析,得到该方法的加标回收率为88.3%-109.6%,符合回收率要求(80%-120%)。因此,本研究中建立的基于Taqman探针的实时免疫PCR检测方法适用于农产品产品中OTA的检测。3.研究建立农产品OTA的实时免疫多引物滚环等温扩增检测方法。本研究使用标准浓度的phage VHH 2-21,从引物浓度、phi29 DNA聚合酶浓度、酵母焦磷酸酶浓度三个主要参数优化实时免疫多引物滚环扩增的扩增条件。采用上述优化的phage VHH 2-21和包被抗原最佳免疫工作浓度和实时免疫多引物滚环扩增的最佳扩增条件建立标准曲线,得到其灵敏度为0.044 ng/mL,检测限为0.004 ng/mL。采用玉米、大米和小麦三种基质对实时免疫多引物滚环扩增进行基质效应评价,得出经过添加BSA或用石油醚脱脂处理后的基质对该方法的影响不显著。采用2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL,三个梯度赭曲霉毒素A标准品进行添加回收分析,得到该方法的加标回收率为88.2%-112.2%,符合回收率要求(80%-120%)。因此,本研究中建立的实时免疫多引物滚环等温扩增检测方法适用于农产品产品中OTA的检测。