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第一部分SNHG10在上皮性卵巢癌组织和细胞中的表达、生物学功能及其临床意义目的:研究lncRNA SNHG10在上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)组织和细胞中的表达水平及其生物学功能,并分析其表达水平与EOC患者生存和预后的相关性。方法:1.生物信息学分析确定EOC中差异表达的lncRNA。2.收集2015年5月至2016年5月在河北医科大学第四医院妇科行卵巢肿瘤减灭术的EOC患者的肿瘤组织和相对应的输卵管组织85对,并通过采用qRT-PCR法检测85例EOC组织及相应输卵管组织中SNHG10的表达水平;同时检测EOC细胞中SNHG10的表达水平。3.采用Kaplan-Meier法分析SNHG10表达水平与EOC患者生存的相关性。4.采用多变量Cox回归模型评估SNHG10表达水平对EOC患者预后的影响。5.采用脂质体转染方法,构建SNHG10过表达的EOC细胞系。6.采用CCK-8实验方法检测过表达SNHG10对EOC细胞增殖能力的影响;采用平板克隆形成实验检测过表达SNHG10对EOC细胞克隆形成能力的影响;采用划痕愈合实验检测过表达SNHG10对EOC细胞迁移能力的影响;采用Transwell实验检测过表达SNHG10对EOC细胞侵袭能力的影响。结果:1.生信分析结果显示,5条lncRNA在EOC组织中差异表达:SNHG10、TRHDE-AS1、linc00476、linc00893和NR2F2-AS1。2.qRT-PCR结果显示,与相应的输卵管组织相比,EOC组织中SNHG10、TRHDE-AS1、linc00476、linc00893和NR2F2-AS1 mRNA的表达水平均显著下调,其中SNHG10表达水平最低(P<0.01);与正常卵巢上皮细胞IOSE80相比,EOC细胞A2780,SKOV3,OVCAR3,OV90中SNHG10 mRNA的表达水平显著下调(P<0.01)。3.Kaplan-Meier生存分析显示,相对于SNHG10高表达组,SNHG10低表达组患者的无疾病进展时间(Progress-free survival,PFS)和总生存时间(Overall survival,OS)显著缩短(P<0.01)。4.多元Cox比例风险回归模型分析显示,腹膜转移和SNHG10表达与EOC患者的PFS显著相关(P<0.001);淋巴结转移、腹膜转移、SNHG10表达与EOC患者OS显著相关(P<0.05)。SNHG10表达是影响EOC患者预后的危险因素。5.qRT-PCR结果显示,转染SNHG10质粒后,SNHG10-ov组SNHG10的表达水平较EV组显著升高(P<0.01),提示成功构建SNHG10过表达的EOC细胞系。6.CCK-8法和平板克隆形成实验结果示,过表达SNHG10可抑制SKOV3、A2780细胞的增殖能力(P<0.01)。划痕愈合和Transwell小室实验结果显示,过表达SNHG10可抑制SKOV3、A2780细胞的迁移和侵袭能力(P<0.001)。小结:1.SNHG10在EOC组织和细胞中显著低表达,其低表达与EOC患者预后不良密切相关,是影响EOC患者预后的生物标志物。2.SNHG10能抑制EOC细胞的增殖,迁移和侵袭能力,在EOC中发挥抑癌作用。第二部分SNHG10抑制上皮性卵巢癌的机制研究目的:探讨SNHG10通过吸附miR-200a-3p调控其下游靶基因桥接整合因子1(bridging intergrator 1,BIN1)进而抑制EOC上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的作用机制。方法:1.通过Lnc Base v.2数据库进行生物信息学预测可能与SNHG10结合的miRNA分子,根据Pearson Score筛选出评分前十名的miRNAs。2.qRT-PCR法检测过表达SNHG10后上皮性卵巢癌细胞A2780中10个候选miRNAs的表达水平变化,筛选出表达差异最显著的miRNA作为研究对象。3.qRT-PCR法检测EOC组织中miR-200a-3p的表达情况,并分析其与SNHG10表达水平的相关性。4.采用荧光原位杂交实验方法(Fluorescence in situ hybridization,FISH)明确SNHG10在上皮性卵巢癌细胞中的亚细胞定位。5.采用RNA结合蛋白免疫沉淀实验(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)和双荧光素酶报告基因实验验证SNHG10是否能与miR-200a-3p相互作用。6.采用qRT-PCR方法检测miR-200a-3p在EOC细胞中的表达水平。7.通过CCK-8法、平板克隆形成、划痕愈合以及Transwell小室实验检测敲低miR-200a-3p对EOC细胞增殖能力、迁移能力和侵袭能力的影响。8.通过PITA、miRan Da和miRWALK三个数据库预测miR-200a-3p的潜在结合基因。9.采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-200a-3p是否能与BIN1相互作用。10.采用qRT-PCR方法检测,敲低miR-200a-3p后A2780和SKOV3细胞中BIN1 mRNA表达水平的变化;采用Western-blot方法检测,敲低miR-200a-3p后,A2780和SKOV3细胞中BIN1蛋白表达水平的变化。11.免疫组化化学染色(Immunohistochemical staining,IHC)方法检测BIN1在EOC组织中的表达情况。12.采用Kaplan-Meier法分析BIN1表达水平与EOC患者生存的相关性以及SNHG10和BIN1共表达与EOC患者生存的相关性。13.采用脂质体转染方法,将Lipofectamine TM2000分别转染至EOC细胞SKOV3、A2780,将细胞分为EV、SNHG10-ov、EV+miRNA inhibitor NC、EV+miR-200a-3p inhibitor、SNHG10-ov+miRNA mimic NC和SNHG10-ov+miR-200a-3p mimic六组,采用Western blot法检测6组EOC细胞中,BIN1和EMT相关蛋白表达水平的变化情况。14.应用Rescue实验检测过表达SNHG10和过表达miR-200a-3p对EOC细胞增殖能力、迁移能力和侵袭能力的影响。结果:1.Lnc Base v.2预测结果中,根据Pearson Score得分筛选出可能与SNHG10结合的前10名miRNAs。2.qRT-PCR结果显示,过表达SNHG10后,这10个候选miRNAs中有5个miRNAs的表达水平下降(P<0.05),其中miR-200a-3p的表达水平下降最为显著(P<0.001),因此我们最终选择miR200a-3p作为我们的研究对象。3.qRT-PCR结果显示,在EOC组织中miR-200a-3p呈高表达状态,且与SNHG10的表达水平呈负相关(P<0.001)。4.FISH结果提示,SNHG10和miR-200a-3p共定位于A2780和SKOV3细胞的细胞质中。5.RIP实验和双荧光素酶报告基因实验结果显示,SNHG10在A2780和SKOV3细胞中能作为ceRNA与miR-200a-3p相互作用(P<0.001)。6.qRT-PCR结果显示,与正常卵巢上皮细胞IOSE80相比,EOC细胞A2780,SKOV3,OVCAR3,OV90中miR-200a-3p的表达水平显著上调(P<0.001)。7.CCK-8法和平板克隆形成实验结果显示,敲低miR-200a-3p可明显降低EOC细胞的增殖能力(P<0.01)。划痕愈合和Transwell小室实验结果显示,敲低miR-200a-3p可明显抑制EOC细胞的迁移和侵袭能力(P<0.001)。8.PITA、miRan Da和miRWALK三个数据库预测了可以与miR-200a-3p结合的靶基因,通过重叠交叉,我们最终确定了BIN1作为下游的靶基因。9.双荧光素酶报告基因实验结果显示,在EOC细胞中miR-200a-3p能够与BIN1相互作用(P<0.001)。10.qRT-PCR结果显示,敲低miR-200a-3p的表达可以促进A2780和SKOV3细胞中BIN1 mRNA的表达水平(P<0.001);Western blot结果显示,敲低miR-200a-3p的表达可以促进A2780和SKOV3细胞中BIN1蛋白的表达水平(P<0.001)。11.IHC结果提示,BIN1在EOC组织中呈低表达状态。12.Kaplan-Meier法分析结果显示,在EOC患者中,BIN1低表达患者的PFS和OS明显缩短(P<0.01);SNHG10和BIN1共表达患者的PFS和OS明显延长(P<0.05)。13.Western blot结果显示,与EV组相比,SNHG10-ov组BIN1表达明显上调,EMT相关蛋白上皮标志物E-cadherin表达上调,间质标志物N-cadherin、Vimentin、SNAIL表达下降(均P<0.01);与EV+miRNA inhibitor NC组相比,EV+miR-200a-3p inhibitor组的BIN1表达明显上调,上皮标志物E-cadherin表达上调,间质标志物N-cadherin、Vimentin、SNAIL表达下降(均P<0.01);与SNHG10-ov+miRNA mimic NC相比,SNHG10-ov+miR-200a-3p mimic组BIN1表达明显下调,上皮标志物E-cadherin表达下降,间质标志物N-cadherin、Vimentin、SNAIL表达升高(均P<0.01)。以上结果说明lncRNA SNHG10通过吸附miR-200a-3p上调了BIN1的表达,进而抑制了EOC的EMT进程。14.挽救实验结果显示,过表达SNHG10可抑制EOC细胞的增殖,迁移和侵袭能力(P<0.001),而再过表达miR-200a-3p后可逆转过表达SNHG10引起的EOC细胞增殖,迁移和侵袭能力的减弱(P<0.001)。小结:1.miR-200-3p是lncRNA SNHG10的靶miRNA,在EOC组织中呈高表达状态,miR-200a-3p可以促进EOC细胞的增殖、迁移和侵袭能力,在EOC中发挥促癌作用。2.BIN1是miR-200a-3p的靶基因,在EOC组织中呈低表达状态,与EOC患者预后不良密切相关。3.SNHG10通过吸附miR-200a-3p促进BIN1表达进而抑制了EMT进程,从而在EOC中发挥抑癌作用。第三部分体内验证SNHG10在上皮性卵巢癌中的抑癌作用目的:探索SNHG10/miR-200a-3p/BIN1轴在小鼠体内的抑癌作用,为EOC逆转治疗奠定理论基础。方法:1.通过稳定转染人上皮性卵巢癌细胞A2780,将细胞分为SNHG10过表达对照组(EV)、SNHG10过表达组(SNHG10-ov)。2.将两组人上皮性卵巢癌细胞A2780收集起来,皮下注射至4周龄雌性裸鼠的右侧腹股沟处,每组5只,构建裸鼠上皮性卵巢癌移植瘤模型。3.每3天将裸鼠称重;每周用直尺体外测量裸鼠移植瘤长径和短径,绘制移植瘤生长曲线;5周后,处死裸鼠后取出原发肿瘤拍照并称重。4.qRT-PCR法检测小鼠肿瘤组织中SNHG10和miR-200a-3p的表达水平。5.IHC方法检测小鼠肿瘤组织中BIN1、N-Cadherin蛋白和E-Cadherin蛋白的表达水平。结果:1.肿瘤生长曲线显示,SNHG10-ov组的移植瘤生长速度明显低于EV组(P<0.05)。并且SNHG10-ov组肿瘤的大小、重量也明显小于EV组(P<0.001)。说明过表达SNHG10可显著抑制小鼠体内肿瘤的生长。2.qRT-PCR结果显示,SNHG10-ov组SNHG10的表达水平显著高于EV组(P<0.01);SNHG10-ov组miR-200a-3p的表达水平显著低于EV组(P<0.01)。3.IHC结果显示,与EV组相比,SNHG10-ov组BIN1和上皮标记物E-Cadherin蛋白表达水平升高,间质标记物N-Cadherin蛋白表达水平下降(均P<0.05)。小结:1.SNHG10可以抑制小鼠移植瘤的生长。2.SNHG10可能是通过miR-200a-3p/BIN1轴在小鼠体内发挥了抑癌作用。结论:1.lncRNA SNHG10在EOC组织中低表达,其低表达与EOC患者预后不良密切相关,是影响EOC患者预后的生物标志物,在EOC中发挥了抑癌作用。2.SNHG10可作为ceRNA直接结合miR-200a-3p促进BIN1表达上调,进而抑制EMT进程,从而发挥其在EOC中的抑癌作用。