论文部分内容阅读
第一部分 临床研究:广州中医药大学第一附属医院热毒血瘀型ACS用药规律研究目的:冠心病是临床常见病,且在我国呈发病率持续上升的趋势,现代研究表明热毒血瘀是冠心病的基本病机之一,岭南地区气候湿热,人们多食甘味,更易形成热毒蕴结型冠心病,本研究目的为探讨广州中医药大学第一附属医院治疗热毒血瘀型冠心病患者的用药规律,为临床治疗提供依据。方法:收集2018年1月至2019年1月广州中医药大学第一附属医院心血管科主任医师门诊治疗冠心病热毒血瘀病例的处方,应用“中医传承辅助平台”软件进行数据整理与挖掘,分析与总结医院热毒血瘀冠心病患者的用药规律。结果:1.纳入病例238例,处方238首,药物共计185味。2.使用频次≥30的有19味药,使用频次≥60的有13味药,分别为丹参(216)、红花(198)、川芎(197)、赤芍(190)、毛冬青(176)、黄芩(175)、降香(173)、黄芪(85)、大枣(83)、竹茹(69)、半夏(67)、瓜蒌皮(65)、延胡索(64)。3.设置支持度个数为160,置信度为0.90,按药物组合频次由高到低排序,得到常用药对及组合40个,前3位分别是川芎-丹参、红花-川芎、赤芍-川芎。4.结合经验判断和不同参数提取数据的预读,设置相关度为6,惩罚度为3,应用复杂系统熵聚类的层次聚类分析,演化出8组核心药物组合,前两位的组合为“毛冬青,桃仁,丹参”“黄芩,毛冬青,赤芍,降香”,并且挖掘了“川芎,丹参,红花,栀子”等新处方4首。结论:我院治疗热毒血瘀型冠心病多用清热活血中药,随症加减益气、化痰之品,体现临证治疗热毒型冠心病以“清热活血药,佐以健脾益气、化痰之法”的治疗理念。第二部分 实验研究:基于自噬探讨黄连解毒汤对AS的作用机制目的:清热解毒法是治疗热毒型冠心病及基本治疗方法,结合团队前期对动脉粥样硬化(AS)清热解毒疗法的探索及我院对于热毒型冠心病患者的用药规律分析,我们选取清热解毒名方黄连解毒汤作为治疗药物,观察黄连解毒汤对新西兰白兔AS的影响,并从巨噬细胞自噬角度探讨其作用机制。方法:1.采用液相-质谱联用的方法对黄连解毒汤冻干粉进行定性、定量检测。2.构建新西兰白兔AS模型,用HE染色及ELISA法,观察黄连解毒汤对兔AS的治疗作用以及对AS相关血清炎症水平的影响。3.通过免疫组化及Western blot的方法观察黄连解毒汤对新西兰白兔血管自噬表型的影响。4.培养巨噬细胞系raw264.7细胞,采用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导其成为泡沫细胞,油红0染色验证泡沫细胞诱导情况。5.RTCA法筛选黄连解毒汤冻干粉溶液(HL)干预细胞的浓度范围,并以不同作用时间及浓度的HL干预细胞,观察其对自噬表型的影响,选择HL的干预时间及浓度。6.细胞电镜、免疫双荧光染色、PCR及Western blot的方法验证正常、模型、HL干预组自噬的表达差异。7.Western blot的法检测通路蛋白 P-PI3K/PI3K、P-Akt/Akt、P-mTOR/mTOR 表达差异,并分别用PI3K激动剂740Y-P、AKt激动剂SC79、mTOR激动剂MHY干预HL组,检测通路蛋白P-PI3K/PI3K、P-Akt/Akt、P-mTOR/mTOR及自噬相关蛋白LC3B、P62表达水平。结果:1.定性检测出黄连解毒汤冻干粉含有巴马汀、杜仲醇、大黄酸、小檗碱等27种成分;定量检测其中七种成分含量为小檗碱0.55 mg/g、黄连碱0.72 mg/g、栀子苷5.02mg/g、黄柏碱 0.46 mg/g、表小檗碱 2.98 mg/g、巴马汀 1.92 mg/g、黄芩苷 0.87mg/g。2.HE染色中,模型组与正常组相比斑块形成,黄连解毒汤低、中、高剂量组及阳性药物阿托伐他汀组与模型组相比斑块减小,且黄连解毒汤中、高剂量组及阿托伐他汀组斑块减小明显。3.兔模型组与正常组相比血清AS相关炎症因子TNF-α、IL-1 β表达水平明显升高(P<0.05),IL-10水平降低(P<0.05),黄连解毒汤各干预组较模型组相比TNF-α、IL-I β表达水平明显均降低(P<0.05),IL-10水平均升高(P<0.05)。4.兔血管组织免疫组化及Western blot检测表明模型组与正常组相比自噬相关蛋白LC3B、bclin-1表达水平均明显降低(P<0.05),黄连解毒汤各干预组较模型组相比LC3B、bclin-1表达水平均升高(P<0.05)。5.细胞油红0染色表明,模型组与正常组相比脂质沉积明显增加(P<0.05),黄连解毒汤干预组较模型组明显减少(P<0.05)。6.RTCA实时检测表明HL浓度在48.83 μ g/ml及以下时不影响细胞增殖;采用40μ g/ml干预泡沫细胞,不同时间点自噬水平较模型组均明显增加,且干预2小时自噬水平最高;分别用10 μ g/ml、20 μ g/ml,40 μ g/ml黄连解毒汤冻干粉干预泡沫细胞2小时,三个干预组较模型组自噬水平均升高,且40 μ g/ml干预时自噬水平最高。7.实时荧光定量PCR及Westernblot检测表明模型组较正常组PI3K、Akt、mTOR的mRNA及蛋白水平均明显升高(P<0.05),HL干预组与模型组相比PI3K、Akt、mTOR的mRNA及蛋白表达水平均降低(P<0.05);Western blot检测表明模型组较正常组P-PI3K/PI3K、P-Akt/Akt、P-mTOR/mTOR 表达水平均明显升高(P<0.05),HL 干预组与模型组相比P-PI3K/PI3K、P-Akt/Akt、P-mTOR/mTOR表达水平均降低(P<0.05);740Y-P组、SC79组、MHY组与HL组相比LC3B表达均明显降低(P<0.01),P62表达均明显升高(P<0.01);740Y-P组与HL组相比P-PI3K/PI3K表达明显增加(P<0.01);SC79组与HL组相比P-Akt/Akt表达增加(P<0.01);MHY组与HL组相比P-mTOR/mTOR表达增加(P<0.01)。结论:黄连解毒汤能够通过抑制PI3K-Akt-mTOR通路增加自噬的机制改善动脉粥样硬化。