捷安肽素是由本实验室分离获得的一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ZK发酵产生的一种具有抑菌活性的抗菌多肽，经结构鉴定其主要成分为伊枯草菌素A(iturinA)。本论文进行了氨基酸分析的方法学研究，建立了毛细管区带电泳分析捷安肽素发酵过程中氨基酸的方法。分析了捷安肽素发酵过程中游离氨基酸浓度的动态变化，结合发酵过程中各种在线离线参数的分析，深入探讨了氨基酸变化与BacillussubtilisZK生长代谢之间的关联。在此基础上采用摇瓶实验考察了单一添加9种氨基酸对捷安肽素发酵的影响，筛选到对发酵有明显促进作用的几种氨基酸，然后采用响应面方法考察了这几种氨基酸的交互作用，并对其复合添加浓度进行优化，为提高捷安肽素产量提供理论依据和有效途径。　　 论文主要包括以下三章的研究内容和结果。　　 第一章:发酵过程中氨基酸分析方法的研究　　 高效毛细管电泳是在传统电泳技术与色谱技术的基础上发展起来的一种强有力的分离分析技术，它具有高效、快速、样品用量少等优点，已经成功地应用于多种不同类型化合物的分离分析。本章采用异硫氰酸苯酯(phenylisothiocyanate，PITC)对氨基酸进行柱前衍生，分别考察了毛细管区带电泳（CapillaryZoneElectrophoresis，CZE）和毛细管胶束电泳（MicellarElectrokineticChromatography，MEKC）两种不同分离模式下苯氨基硫甲酰(phenylthiocarbamyl，PTC)-氨基酸的分离效果，结果表明毛细管区带电泳对PTC-氨基酸的分离效果较好;进而考察了毛细管区带电泳分离分析PTC-氨基酸的条件参数，得出缓冲液β-环糊精添加浓度为3mM，pH为7.0时分离效果最佳，确定了最佳分离条件为以30mM磷酸盐+3mMβ-环糊精(pH7.0)为缓冲体系，电压为20kV，检测波长为254nm，该条件下可分离20种常见氨基酸中的17种;在分离分析过程中，引入了内标物质——对氨基苯甲酸(p-aminobenzoicacid，PABA)，有效的克服了系统误差;对毛细管区带电泳法测定氨基酸进行了方法学验证，其线性结果和精密度结果良好。采用此方法测定了捷安肽素发酵培养基中游离氨基酸含量，并与氨基酸分析仪测定结果进行对比，两者分析结果较一致，证明该方法可用于发酵过程中游离氨基酸含量的测定。成功建立了毛细管电泳分析捷安肽素发酵过程中氨基酸变化的方法，该方法也适用于其它细菌发酵过程中氨基酸的分析测定。　　 第二章:捷安肽素发酵过程中氨基酸的动态分析　　 通过分析5L发酵罐分批发酵和补料-分批发酵的细胞生长代谢曲线，发现相比分批发酵，碳源和氮源的流加使细胞浓度增加了228％，效价提高了36％。分析了对产物效价影响很大的两种蛋白胨中的氨基酸含量，发现两者氨基酸含量差别较大，其中，效价较高蛋白胨中Asp、Thr、Val、Met、Ile、Leu、Lys和His的含量相比效价很低蛋白胨中相应氨基酸含量高出50％以上。结合iturinA分子结构，重点考察了发酵过程中Asp、Glu、Ser、Tyr、Pro、Thr、Lys、Val和Leu这9种氨基酸的动态变化。通过对分批发酵和补料-分批发酵过程中胞外9种游离氨基酸浓度的动态变化，发现除Asp和Tyr的7种氨基酸有两次消耗高峰，一是3-6h，菌体生长处于对数期;二是15-24h（补料分批为18-30h），菌体生长处于稳定期。另外，对发酵过程中表征细胞代谢特性的参数，摄氧率(OUR)、二氧化碳释放率(CER)、呼吸商(RQ)以及pH，进行了相关性分析，结合氨基酸的动态变化，确定了发酵过程中氨基酸的关键调控点为细胞生长对数期和细胞生长稳定期，选择Asp、Asn、Glu、Gln、Ser、Tyr、Pro、Thr、Lys这9种氨基酸作为下一步重点考察对象。采用建立的毛细管电泳法可有效地分析捷安肽素液体深层发酵过程中游离氨基酸的变化，深入理解发酵过程中氨基酸的代谢规律，为有目的调控氨基酸水平优化发酵过程提供有效的技术手段。　　 第三章:添加氨基酸对捷安肽素发酵的影响研究　　 在BacillussubtilisZK8摇瓶发酵的两个不同时段，即发酵12h(细胞生长处于对数期)与24h（细胞生长处于稳定期），以补加的方式考察了9种氨基酸(Asp，Asn，Glu，Gln，Ser，Pro，Tyr，Thr，Lys)对捷安肽素发酵的影响。结果表明，在考察的浓度范围内，发酵12h时Asn、Asp、Pro和Lys的添加有利于细胞生长，当添加浓度分别为150mg/L、160mg/L、150mg/L和150mg/L时对细胞生长的促进作用最强。在考察的9种氨基酸中，仅Asn和Asp的添加有利于产物活性的提高，当添加浓度分别为150mg/L和160mg/L时产物活性相比对照组提高最大;低浓度Ser、Tyr、Thr和Lys的添加对产物活性没有显著影响，当添加浓度分别达80mg/L，50mg/L，80mg/L和200mg/L时，则不利于产物合成，产物活性相比对照显著降低。　　 在考察的浓度范围内，发酵24h时Gln、Ser和Lys的添加有利于细胞生长，当添加浓度分别为100mg/L，60mg/L和200mg/L时对细胞生长的促进作用最强;Asn、Asp、Glu和Pro的添加有利于产物活性的提高，当添加浓度分别为100mg/L、200mg/L、300mg/L和100mg/L时产物活性相比对照组提高最大;低浓度Lys的添加对产物活性没有显著影响，当添加浓度达200mg/L时则不利于产物合成，产物活性相比对照组显著降低。　　 在单因素实验基础上，利用响应面方法(ResponseSurfaceMethodology,RSM)考察了氨基酸复合添加对捷安肽素发酵的影响。发酵12h时选择对细胞生长有显著促进作用的氨基酸（Asn、Pro和Lys）进行复合添加，根据中心组合设计原理，以发酵结束时细胞浓度为响应值，设计三因素五水平的优化试验，用DesignExpert8.0软件进行设计和结果的统计学分析并建模，得到氨基酸复合添加浓度的最优组合为156.3mg/LAsn+153.3mg/LPro+155.5mg/LLys，发酵12h时添加此最优的氨基酸组合，细胞浓度达3.91×109/mL，相比对照组提高了42.7％。摇瓶发酵24h时选择对产物活性提高有促进作用的氨基酸（Asn、Glu和Pro）进行复合添加，采用Box-Behnken设计优化氨基酸的复合添加浓度，得到最优浓度组合为145.6mg/LAsn+254.8mg/LGlu+50mg/LPro，发酵24h添加此最优的氨基酸组合，效价达13230U/mL，相比对照组提高了28.6％。以实现捷安肽素发酵高细胞密度和高产量为目标，首次分别在细胞生长对数期和稳定期添加外源氨基酸，得到有利于捷安肽素发酵的氨基酸种类，并采用响应面设计成功优化了氨基酸的复合添加浓度，结果细胞浓度和捷安肽素产量都明显提高。