【摘 要】
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β-半乳糖苷酶(β-gal)作为一个典型的酶,已经被证明是一个重要的研究细胞衰老的生物标记物。而目前与衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)是体外和体内最广泛使用的细胞衰老
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β-半乳糖苷酶(β-gal)作为一个典型的酶,已经被证明是一个重要的研究细胞衰老的生物标记物。而目前与衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)是体外和体内最广泛使用的细胞衰老的生物标记物,故实时监测亚细胞水平的β-gal活性至关重要。近年来许多研究都主要通过荧光探针在生物体系中进行可视化成像来研究细胞衰老。本研究的主要目的:通过解析β-半乳糖苷酶与荧光探针分子的三维晶体结构,阐明其主要相互作用,揭示β-半乳糖苷酶识别荧光探针的结构生物学基础,为以后荧光探针分子的设计和优化提供依据。本论文构建了来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶(E.coliβ-gal)“TIM”催化结构域的活性氨基酸Glu537的突变体E537Q的表达菌株:sumo-β-gal E537Qp ET21a/BL21(DE3)以及通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建人源的β-半乳糖苷酶(humanβ-gal)的表达菌株:humanβ-gal-p Fast Bac/DH10Bac。之后经进一步表达提纯成功获得纯度大于95%的E.coliβ-gal E537Q蛋白。然后我们通过浸泡法获得三种经筛选的荧光分子(GY1,GY2,KSL01)与突变体E537Q的复合物晶体,通过X射线衍射收集数据并成功解析三种复合物的晶体结构。分析比较复合物结构表明:E.coliβ-gal是同源四聚体,但单体的空间堆积方式与报道过(PDB ID:1jz7)的不同;比较三种探针与E.coliβ-gal的作用方式发现:除了与糖基的结合,Trp999与探针的苄基环之间都存在π-π堆积相互作用,因此推测π-π相互作用对于稳定探针与E.coliβ-gal的结合非常重要;此外,该苄基环将探针分子延伸到狭窄的β-gal结合口袋之外,使探针的发光基团与β-gal之间不存在较大位阻,有利于探针的结合;比较在活性位点的探针分子的电子密度发现GY1和KSL01结构比较灵活,B因子偏高。因humanβ-gal表达成功,但纯化并未成功,所以我们通过分子对接获得humanβ-gal与探针分子的复合物结构,结合催化机理以及作用方式分析得出:humanβ-gal可能通过相似的相互作用网络识别探针。将荧光探针用于生物体系内β-半乳糖苷酶识别与可视化成像已经得到广泛的研究,但是我们首次通过结构揭示酶E.coliβ-gal识别荧光探针的机理,这对以后荧光探针的设计和优化提供了结构生物学基础。
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