【摘 要】
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降钙素原蛋白质（PCT）作为细菌性感染的高特异性生物标志物大量应用于炎症类疾病诊断的试剂研发和试剂盒生产,因此开展PCT分离提纯工艺研究具有重要的应用需求和研究意义。本论文以含PCT的复杂血清为原料,采用免疫亲和原理,进行分离与提纯PCT工艺的设计与实验研究,并建立便于评价PCT分离效果的液质检测方法,主要研究内容如下。首先,建立一种用于PCT检测的肽段酶解-液质法,为PCT的分离奠定基础。其原理
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降钙素原蛋白质（PCT）作为细菌性感染的高特异性生物标志物大量应用于炎症类疾病诊断的试剂研发和试剂盒生产,因此开展PCT分离提纯工艺研究具有重要的应用需求和研究意义。本论文以含PCT的复杂血清为原料,采用免疫亲和原理,进行分离与提纯PCT工艺的设计与实验研究,并建立便于评价PCT分离效果的液质检测方法,主要研究内容如下。首先,建立一种用于PCT检测的肽段酶解-液质法,为PCT的分离奠定基础。其原理是采用酶解将PCT分解成多条肽段,利用液质联用仪检测肽段浓度,进而计算得到PCT浓度。实验采用单因素试验法,研究酶解过程中胰蛋白酶用量、酶解时间等因素对酶解效果的影响。结果表明,在优化条件下,即胰蛋白酶和PCT质量比为1:5,酶解时间12 h时,所得PCT酶解效率最好,得到多条特定位点断裂且在质谱上有高响应且能稳定出现的肽段,由此计算得到PCT浓度为0.551 mg/g,该结果与技术成熟——氨基酸水解法的测量结果一致,两种方法检验的相对偏差为2.5%,表明所建立的肽段酶解-液质法是可靠的。另外该方法的突出优点是采用的特征肽段检测,增强了检测方法的抗干扰能力,减少测量误差。其次,从免疫亲和原理出发,设计从复杂血清混合物中分离与提纯PCT的工艺。分离工艺的组成包括免疫亲和单元、富集单元、洗脱单元和酶解检测单元。在免疫亲和单元中,采用表面等离子共振系统对PCT四种抗体与PCT的亲和力大小进行表征,发现抗体的亲和力顺序为MB1＞MB3＞MB4＞MB2,因此选用MB1作为免疫亲和的抗体。在富集单元中,系统研究分离过程中PCT与MB1摩尔比对富集效率的影响,结果表明PCT和MB1摩尔比为1:3时富集效果较好。在洗脱单元中,采用单因素试验法,分别考察洗脱剂种类、洗脱剂用量和洗脱时间等因素对PCT分离效果的影响,实验结果表明5 vol%乙酸洗脱剂,洗脱剂用量为300m L/mg（PCT）,洗脱时间2 h时洗脱效果较好。在酶解测试单元中,选用优化后的条件,按照设计的PCT分离工艺进行实验,并进行酶解和检测,检测方法选用已建立的肽段酶解-液质法,分离效率经计算可达到96.09%,满足从复杂基质中分离PCT的产品要求。高分离效果得益于MB1抗体对PCT的高效亲和作用,这是对实际血清中PCT有效富集的关键。此外,对富集和洗脱条件进行了大量优化,这使得分离工艺更加完善,该工艺的开发可帮助PCT免疫试剂盒以及诊断试剂的研发。
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