脑缺氧导致严重的细胞变性,因而脑功能丧失。当前普遍认为,缺氧损伤中谷氨酸大量释放,导致细胞内过量的Ca2+蓄积,从而引起神经元死亡。钠泵又称Na+, K+-ATP酶,是一种膜结合蛋白,可通过水解一分子ATP将三个Na+转运到细胞外同时摄取两个K+进入细胞,产生电化学梯度,维持细胞渗透压平衡和静息电位,因此钠泵是维持Na+动态平衡、体液和电解质稳态的关键。当哺乳动物脑组织的氧或血流供应低于临界值时就会出现能量障碍,仅仅缺氧5 min ATP下降90%,而丢失50～60%的ATP时钠泵活性下降,细胞膜去极化进而钠和水进入细胞内。去极化使电压门控性钙通道开放Ca2+内流,同时崩塌的Na+梯度引起Na+依赖性谷氨酸转运体排除谷氨酸到细胞间隙,激活谷氨酸受体导致大量Ca2+内流,继而出现Ca2+依赖性细胞损伤。由此可见,钠泵在脑缺血的发生、发展过程中起着重要的作用。但目前对其研究大多数集中在心肌细胞、肾脏、骨骼肌、血管平滑肌,而对脑组织钠泵的分布及功能特性研究较少,特别是其在脑缺血、缺氧状态下,功能和特性的改变及其可能机制的研究甚少,本研究旨在选取对缺血较敏感的皮层神经元(Ⅴ和Ⅵ层锥体细胞),研究钠泵电生理特性及其在缺氧中的改变,并探讨其可能机制。一、脑片皮层神经元钠泵的电生理特性目的:应用脑片皮层神经元研究钠泵电流的特性。方法:选取出生11~14天SD大鼠,深度麻醉后断头,快速取出脑组织放入冰冷的人工脑脊液(ACSF)中,取前脑切成300μm的薄片,储存在95%O2+5%CO2饱和的ACSF中。然后将制备好的皮层脑片放置于灌流槽中,持续灌流95% O2和5% CO2饱和的ASCF,流速为1～2ml/min,使脑片浸没于液面下。在红外微分干涉相差显微镜下,移动电极至细胞上方负压吸引形成封接,再以负压吸破细胞膜,使电极内液与细胞内液相通,并将细胞钳制在-60mV,当膜电流稳定时,先通过膜去极化程序(-60mV—0mV—-60mV)激活Na+电流来鉴别正在记录的细胞是神经元,然后换为含不同浓度哇巴因(Oua,10-12～10-3 mol/L)的ACSF,以全细胞膜片钳方式记录皮层神经元钠泵电流,并以10-3 mol/L Oua产生的泵电流幅度为100%,计算各浓度Oua产生的泵电流(Ip)的变化率(ΔIp),并以此为纵坐标,以Oua浓度([Oua])为横坐标,绘制ΔIp-[Oua]关系曲线。整个实验在室温(23±2℃)下进行结果:实验结果表明,当膜电压钳制在-60mV时,低浓度Oua灌流可引起膜电流的外向移动,但较高浓度的Oua灌流,则可剂量依赖性引起膜电流的内向移动,其中1 mmol/L Oua引起的膜电流内向移动幅度与切换无K细胞外液所致的膜电流内向移动幅度相同,证明该Oua敏感性电流为钠泵电流。本研究采用10-12~10-3 mol/L的Oua分别在96个神经元测定了泵电流,根据神经元钠泵对10-8 mol/L Oua的反应,可将钠泵电流对Oua(10-12～10-3 mol/L)的ΔIp-[Oua]关系曲线分为兴奋、抑制和无作用三种模式,。兴奋模式ΔIp-[Oua]关系曲线中10-12～10-3 mol/L Oua所对应的ΔIp值分别是0.027±0.114、0.032±0.082、0.050±0.213、0.172±0.226、0.125±0.152、-0.035±0.036、-0.146±0.124、-0.226±0.161、-0.421±0.076、-0.638±0.138和-1。其ΔIp-[Oua]关系曲线呈三位点结合特征,采用双亚基三位点结合模型可进行最优拟和,包括高亲和力兴奋性位点、高亲和力抑制性位点和低亲和力抑制性位点,其解离常数分别为0.31 nmol/L、41.27 nmol/L和152.48μmol/L。抑制模式ΔIp-[Oua]关系曲线中10-12～10-3 mol/LOua所对应的ΔIp值分别是-0.011±0.072、-0.028±0.071、-0.057±0.079、-0.093±0.063、-0.115±0.069、-0.124±0.067、-0.157±0.094、-0.281±0.144、-0.421±0.076、-0.690±0.112和-1.0。其ΔIp-[Oua]关系曲线呈两位点结合特征,采用双位点结合模型可进行最优拟和,包括高亲和力抑制性位点和低亲和力抑制性位点,其解离常数分别为71.12μmol/L和176.51μmol/L。无作用模式ΔIp-[Oua]关系曲线中10-12~10-7 mol/L Oua对钠泵电流无作用,10-6～10-3 mol/L Oua剂量依赖性抑制钠泵电流。其ΔIp-[Oua]关系曲线呈单位点结合特征,采用单位点结合模型可进行最优拟和,仅包括低亲和力抑制性位点,其解离常数为149μmol/L。综合以上三种模式,高亲和力钠泵电流占总泵电流的14.59%,可能经α2或α3亚基介导,而低亲和力钠泵电流占总泵电流的85.41%,可能经α1亚基介导。此外,钠泵电流还拥有电压依赖性,其I-V曲线从-90～+40 mV电压范围斜率为正值,翻转电位在-20 mV左右。结论:皮层的锥体神经元表达两种功能不同的钠泵,即高亲和力钠泵和低亲和力钠泵。钠泵电流不仅具有Oua敏感性还具有电压依赖性。二、缺氧对皮层神经元钠泵的影响目的:研究缺氧对皮层神经元钠泵活性和α亚基表达的影响。方法:通过缺氧培养皮层神经元以及用N2饱和的无糖ACSF灌流皮层脑片,建立皮层神经元的氧糖分离缺氧模型。通过检测缺氧0、2、4、8和12小时后培养皮层神经元培养基中乳酸脱氢酶(LDH)含量,评价缺氧对培养皮层神经元的损伤程度;应用激光共聚焦显微镜检测缺氧0、0.5、1、2、4和8小时后培养皮层神经元内Ca2+浓度([Ca2+]i)(fluo-3的荧光强度)的变化;采用TTC染色评价缺氧0、5、10、15、30、45和60min对皮层脑片神经元活性的影响。通过无机磷分光光度计法,检测缺氧培养皮层神经元在缺氧0、2、4和8小时钠泵活性的改变;通过双酶法,检测皮层脑片缺氧0、15、30和60min时钠泵活性的改变。采用脑片膜片钳装置观察缺氧0、2、4、6、8、10、15和20min对脑片皮层神经元钠泵电流的改变。采用RT-PCR和Westernblot方法,观察缺氧0、4、8和12小时对培养皮层神经元α1和α3亚基mRNA和蛋白表达的影响,以及缺氧0、5、10、15、30和60min对皮层脑片α1和α3亚基mRNA和蛋白表达的影响。结果:当培养的皮层神经元缺氧达4 h时,培养基中的LDH从正常状态下的324±16增加到417±50 U/L(p<0.05),随着缺氧时间的延长,培养基中的LDH显著增加,缺氧8 h时为584±98 U/L,缺氧12 h增加到791±87 U/L(p<0.05),提示缺氧可引起皮层神经元损伤。细胞内Ca2+超载是细胞受损另一具体表现,在无糖和缺氧培养条件下,培养的皮层神经元[Ca2+]i持续升高,在缺氧1 h时达到高峰(1.71±0.46),且在缺氧2、4和8 h时仍维持在高峰水平。用无糖低氧ACSF持续灌流皮层脑片仅5 min,活性即有明显降低(0.292±0.019,P<0.01),直至缺氧15min降低幅度并无明显改变,然而当缺氧时间继续延长时急剧下降(0.257±0.012,P<0.01)。随缺氧培养时间的延长,皮层神经元钠泵活性先升高后降低,正常状态下钠泵活性为1626±122μmol/NADH/mg·protein/h,缺氧培养2 h时其活性明显上升(4114±472μmol/NADH/mg·protein/h,p<0.01),然后钠泵活性随缺氧时间的延长逐渐下降,在缺氧4 h时显著减小到864±318μmol/NADH/mg·protein/h(p<0.01),继续缺氧到8 h时,其钠泵活性进一步大幅度下降,显著低于缺氧4 h时( 497±86μmol/NADH/mg·protein/h,p<0.05)。正常的皮层脑片钠泵活性是169±32μmol/mg protein/h,在缺氧30 min时其活性为572±28μmol/mg protein/h,显著高于正常皮层脑片(P<0.05),但在缺氧60 min后,脑片钠泵的活性则明显下降(243±72μmol/mg protein/h,P<0.05)。皮层脑片分别缺氧0、2、4、6、8、10、15和20 min后,钠泵电流先降低后升高。在缺氧4 min后钠泵电流即显著降低(从0.265±0.068 pA/pF降至0.160±0.046 pA/pF,P<0.01),但是当神经元缺氧20 min后泵电流却明显升高,为0.243±0.054 pA/pF(P<0.05)。用高浓度Oua(1mmol/L)完全抑制钠泵功能后,用95% O2和5% CO2饱和的ACSF冲洗,维持正常生理环境,则膜电流可恢复到未给Oua的初始水平,表明钠泵功能可以恢复。但若给予用95% N2和5% CO2饱和的ACSF冲洗,则膜电流不能恢复到未给Oua的初始水平,表明其钠泵功能在缺氧状态下不能恢复,提示缺氧可抑制钠泵功能。缺氧导致培养皮层神经元钠泵α1亚基mRNA表达增加,在缺氧0、2、4、8和12 h时mRNA水平分别为0.822±0.050、0.873±0.096、0.960±0.089、0.938±0.080和0.829±0.098,在缺氧4和8 h时有显著差别(p<0.01);α3亚基mRNA水平的改变与α1相反,出现下降的改变。在缺氧8 h时mRNA水平由0 h的1.173±0.156显著下降到0.540±0.076(p<0.01),到第12 h仍维持在较低水平0.536±0.100(p<0.01)。离体皮层脑片分别缺氧5、10、15、30和60 min后,α1和α3亚基mRNA表达随缺氧时间的延长变化不明显(P>0.05)。缺氧培养皮层神经元钠泵α1亚基的蛋白水平增加,同其mRNA的改变,在缺氧0、4和8 h时蛋白相对含量分别为0.471±0.0519、0.517±0.152和0.573±0.106 ,呈现增加的趋势但没有统计学意义( p>0.05),在缺氧12 h时蛋白含量显著增加到0.806±0.0776(p<0.01)。α3亚基的蛋白水平在缺氧后的变化也同其mRNA水平的改变,有明显的下降。在缺氧4 h时蛋白水平由0 h的0.730±0.065下降到0.501±0.097(p<0.05),以后随缺氧时间的延长而持续下降,8和12 h分别为0.446±0.077和0.448±0.109(p<0.01)。缺氧培养的皮层神经元上,α1亚基随缺氧时间的延长可见神经元荧光强度明显增强,而α3亚基明显减弱,支持蛋白的改变。离体皮层脑片分别缺氧15、30和60 min后,钠泵α1和α3亚基蛋白水平无明显改变(P<0.05)。结论:采用缺氧孵育脑片和缺氧培养神经元模型可成功模拟两种不同的缺氧性脑损伤。在缺氧早期阶段皮层神经元钠泵活性代偿性升高,但随缺氧时间的逐渐延长活性降低。缺氧培养调节皮层神经元mRNA和蛋白水平的表达,α1亚基表达升高,α3亚基表达降低三、低亲和力钠泵参与了皮层神经元缺氧损伤目的:比较皮层神经元高亲和力钠泵和低亲和力钠泵在缺氧损伤中的作用。方法:通过灌流不同时间无糖低氧ACSF,制备培养的皮层神经元和皮层脑片的氧糖分离模型。缺氧0、2、4、6、8或10min观察皮层脑片神经元膜电流的改变(?I/Cm),或者给予TTX(1μmol/L)后同时缺氧,或者缺氧6min时给予TTX继续缺氧观测膜电流的改变。钠泵对缺氧所致皮层脑片神经元膜电流变化的影响:采用Oua 10 nmol/L兴奋高亲和力钠泵、Oua 100 nmol/L抑制高亲和力钠泵或者Oua 10μmol/L部分抑制低亲和力钠泵后,检测缺氧0、2、4、6、8和10 min时?I/Cm。钠泵对缺氧所致皮层脑片神经元[Ca2+]i和[Na+]i变化的影响:采用可视化动缘探测系统检测培养的皮层神经元[Ca2+]i和[Na+]i荧光信号(Fura-2 10μmol/L和SBFI 10μmol/L),①无氧无糖的HBS灌流培养的皮层神经元10 min,分别于缺氧0、2、4、6、8和10 min时测定神经元[Ca2+]i荧光比值(?Ratio),比较不同时间点?Ratio。②连续灌流含Oua(10-9～10-3 mol/L)的正常HBS 2 min,测定[Na+]i ?Ratio。③以Oua 100 nmol/L、10μmol/L或1 mmol/L的正常HBS预先处理皮层神经元,然后换为含有同样浓度Oua的无氧无糖HBS,连续记录10 min,测量0、2、4、6、8和10 min时神经元[Ca2+]i ?Ratio。结果:缺氧增大神经元膜电流:无糖低氧ACSF灌流10 min,神经元膜电流则逐渐增大(P<0.01),在缺氧0、2、4、6、8和10 min时,其增加的膜电流密度分别为0、-0.014±0.006、-0.028±0.013、-0.035±0.016、-0.044±0.022、-0.058±0.026和-0.074±0.025 pA/pF,呈时间依赖性升高(r=0.98028,P<0.01),说明缺氧可引起皮层神经元膜上离子通道的异常开放。缺氧增大的膜电流为TTX敏感性Na通道电流:在阻断K+和Ca2+通道的液体环境中,所记录到的膜电流主要为钠电流,缺氧引起的脑片皮层神经元膜电流增加可以被TTX(1μmol/L)阻断。若先使神经元急性缺氧6 min后再给予TTX,则TTX可抑制缺氧增加的膜电流继续增大,仅使其维持在缺氧6 min时的电流水平而不能恢复至正常,在10 min时,膜电流的改变值为-0.033±0.013 pA/pF,与缺氧10 min时-0.058±0.028 pA/pF相比较有显著差异(P<0.01)。提示缺氧引起的膜电流增加可能与去极化所致的钠通道开放有关。钠泵对缺氧增大皮层神经元膜电流的影响:Oua 10μmol/L部分阻断低亲和力钠泵可促进缺氧所致膜电流的增大,在缺氧0、2、4、6、8和10 min时,?I/Cm分别为0、-0.031±0.010、-0.041±0.013、-0.053±0.007、-0.057±0.008和-0.069±0.012 pA/pF(P<0.05)。Oua 100 nmol/L的条件下急性缺氧10 min,?I/Cm呈降低趋势,分别为0、-0.021±0.003、-0.028±0.006、-0.038±0.016、-0.047±0.018和-0.055±0.020 pA/pF(P>0.05),但当同时给予Oua 10 nmol/L和缺氧, ?I/Cm较单纯缺氧明显减小,分别为0、-0.009±0.011、-0.011±0.015、-0.010±0.016、-0.009±0.018和-0.012±0.020 pA/pF ,(P<0.01),表明10 nmol/L Oua在一定程度可保护皮层神经元对抗缺氧性损伤。Oua对培养皮层神经元[Ca2+]i和[Na+]i的影响:有氧状态下,不同浓度的Oua抑制钠泵剂量依赖性地显著升高皮层神经元[Na+]i和[Ca2+]i。当Oua的浓度为10-5～10-3mol/L时,[Na+]i的ΔRatio值显著增加,分别为0.017±0.004、0.030±0.004和0.035±0.004(P<0.01);当Oua的浓度为10-7～10-3mol/L时, [Ca2+]i的ΔRatio值显著增加,分别为0.056±0.013、0.107±0.018、0.158±0.011、0.185±0.016和0.192±0.014(P<0.05或P<0.01),提示抑制钠泵可升高皮层神经元[Ca2+]i。缺氧使培养皮层神经元[Ca2+]i呈时间依赖性增加,在缺氧0、2、4、6、8和10 min时,[Ca2+]i的ΔRatio值分别为0、0.0220±0.0012、0.0693±0.0052、0.1047±0.0148、0.1397±0.0165和0.1637±0.0122,显著高于缺氧前(P<0.01)。钠泵对缺氧所致培养皮层神经元[Ca2+]i升高的影响:Oua 10 nmol/L可使缺氧所致的培养皮层神经元[Ca2+]i升高程度较单纯缺氧明显降低(P<0.05),缺氧后0、2、4、6、8和10 min时的ΔRatio值分别为0、0.0163±0.0009、0.0300±0.0050、0.0520±0.0141、0.0710±0.0155和0.0983±0.0183。提示兴奋高亲和力钠泵可部分代偿缺氧所致的培养皮层神经元[Ca2+]i升高。Oua 10μmol/L基础上缺氧,缺氧诱导的[Ca2+]i升高没有明显改变(P>0.05),主要是低亲和力钠泵参与缺氧损伤。Oua 1 mmol/L使正常培养皮层神经元[Ca2+]i值上升到相当高的水平后,缺氧可观察到4 min以内[Ca2+]i维持在缺氧之前的水平(P>0.05),ΔRatio值接近于0,与单纯缺氧相应时间点比较差异显著(P<0.01),提示完全阻断钠泵功能可对抗缺氧损伤最初的[Ca2+]i升高。然而随缺氧时间的延长,皮层神经元[Ca2+]i逐渐上升,在6、8和10 min时分别为0.0200±0.0144、0.0556±0.0141和0.0837±0.0128(P<0.05),与单纯缺氧相应时间点比较差异显著(P<0.01)。结论:缺氧使Na+进入皮层神经元以及[Ca2+]i升高,同时阻断钠泵功能可通过升高皮层神经元[Na+]i水平影响[Ca2+]i,以及完全抑制钠泵功能,可在4 min以内阻断缺氧介导的皮层神经元[Ca2+]i变化,提示钠泵通过间接调节[Ca2+]i参与皮层神经元的缺氧损伤,以及钠泵是缺氧损伤早期阶段的靶点之一,但是,还有其它机制参与了较长时间缺氧的损伤。兴奋高亲和力钠泵可能通过非转运功能对皮层神经元的缺氧损伤有保护作用。