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生长分化因子8(Growth differentiation factor-8,GDF-8),又称为肌肉抑制素(Myostatin),是转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成员之一。GDF-8在人体内广泛参与机体的各项生理功能,在女性生殖系统中也发挥重要作用,在人子宫和胎盘组织中均有表达,可能参与子宫肌瘤的发生、调控胎盘滋养外胚层细胞的增生和迁移。最新的研究表明,GDF-8在调控卵巢生殖活动中具有非常重要的生理作用,参与卵丘扩张及类固醇甾体激素生成的调节。多囊卵巢综合征(Polycystic ovarian syndrome,PCOS)是一种常见的女性内分泌疾病,常伴随生殖功能障碍和内分泌代谢紊乱。根据鹿特丹标准其发病率约为20%,占无排卵性不孕患者的30%-60%,是引起女性不孕的最常见疾病之一。PCOS主要临床表现为排卵障碍、多毛、座疮、肥胖以及代谢紊乱等;超声学改变为卵巢呈多囊样;而其主要的血清学表现则为高雄激素。目前,PCOS的发病机制尚未完全明确,有研究认为高雄激素是引起PCOS各种临床症状和代谢紊乱的主要因素。芳香化酶(Aromatase cytochrome,AROM),也被称为雌激素合成酶,是CYP19A1细胞色素P450超家族成员,是促进雄激素向雌激素转化的关键酶。研究发现AROM在PCOS患者颗粒胞中低表达,这可能是导致PCOS高雄激素症状发生和排卵障碍的关键因素。已有研究表明,GDF-8在人颗粒细胞中参与调控类固醇甾体激素生成过程中各类关键酶的表达,如孕激素生成的关键酶类固醇激素合成急性调节蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein,StAR)和可调控卵泡卵丘扩张的正五聚蛋白3(Pentraxin-3,PTX3)等。2012年,Chen MJ等人研究发现PCOS患者血清中的GDF-8浓度高于正常人群,推测GDF-8有可能参与PCOS的发生发展。亦有研究表明,AROM在PCOS患者颗粒胞中低表达,可能是导致PCOS高雄激素症状发生和排卵障碍的关键因素。但目前关于GDF-8与PCOS发生发展的关系及在人颗粒细胞中对AROM具体的调节机制仍不明确。因此,本研究旨在发现GDF-8在人黄素化颗粒细胞中是否调控AROM的生成和分子机制以及在PCOS高雄激素发生发展中的作用方式。目的研究GDF-8在人颗粒细胞中调控AROM表达的分子机制及在PCOS高雄激素发生发展中的作用方式。方法本研究以人原代颗粒细胞为研究模型,探究GDF-8在AROM表达过程中的调控作用及GDF-8是否通过AROM参与PCOS高雄激素血症的发生。分别观察经GDF-8处理颗粒细胞1h、6h、12h、24h后以及通过50ng/mL及100ng/mL不同浓度的GDF-8处理颗粒细胞后,观察AROM mRNA和蛋白表达水平的变化,研究.GDF-8.对.AROM.的调控是否具有时间和剂量依赖性。使用实时逆转录荧光定量..PCR(Reverse transcription quantitative.real-time PCR,RT-qPCR).检测人黄素化颗粒细胞中.mRNA.的表达水平,使用Western Blot技术检测人黄素化颗粒细胞中蛋白的表达水平。为了验证GDF-8对AROM的调控过程是否通过激活ALK4/5上游信号通路进行,对人颗粒细胞给予.ALK4/5.的特异性受体抑制剂SB431542进行预处理,通过观察细胞中mRNA及蛋白水平的变化明确该抑制剂是否可抑制GDF-8对AROM的调控作用。为了验证GDF-8是否通过Smad2和Smad3下游信号通路参与AROM的调控过程,本研究使用GDF-8对颗粒细胞进行.处.理,检.测.细.胞.中.磷.酸.化.Smad2.和.Smad3.水平的变化。为了进一步确认在GDF-8对AROM的调控过程中Smads信号通路的关键作用,本研究使用Smad4.的SiRNA敲.除.颗..粒细.胞.中.内.源.性Smad4的表达,再观察GDF-8对AROM调控作用的改变。使用酶.联.免.疫.吸.附.测.定.试.验.法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测.非POCS患者与PCOS患者卵泡液原液中GDF-8的浓度。用相同条件的GDF-8对PCOS患者的颗粒细胞进行处理,观察细胞中AROM mRNA和蛋白表达水平的改变,探究GDF-8在PCOS患者颗粒细胞中对AROM的调控作用。结果在人颗粒细胞中,GDF-8能够促进AROM的表达,且其作用具有时间和剂量依赖性。给予颗粒细胞ALK4/5通路受体抑制剂SB431542,发现其可抑制GDF-8对AROM的促进作用,提示了在GDF-8通过激活ALK4/5上游通路参与对AROM的调控作用。给予GDF-8处理颗粒细胞后,细胞内磷酸化Smad2/3的水平显著提高,提示GDF-8通过Smad2/3下游信号通路促进AROM的生成。通过使用Smad4的SiRNA敲除颗粒细胞中内源性Smad4的表达,结果示GDF-8对AROM的调控作用受到了抑制,提示GDF-8通过经典的Smads信号通路调控AROM的生成。使用ELISA检测非POCS患者与PCOS患者卵泡液原液中GDF-8的浓度,结果提示:在PCOS患者卵泡液中GDF-8的浓度显著高于非PCOS患者。用相同条件的GDF-8对PCOS患者的颗粒细胞进行处理,结果GDF-8在PCOS患者的颗粒细胞中明显抑制AROM mRNA和蛋白水平的表达。结论1、在人原代颗粒细胞中,GDF-8可促进AROM mRNA和蛋白水平的表达,且这一调控作用具有时间和剂量依赖性;2、GDF-8对AROM表达的调控是通过活化ALK4/5受体,进而激活经典Smad通路发生的;3、GDF-8在PCOS患者中高表达并抑制AROM的表达,可能与PCOS患者血清高雄激素发生有关。