恶性黑色素瘤是一种起源于黑色素细胞恶性度极高的皮肤肿瘤,近年来其发病率逐年攀升。早期发现的恶性黑色素瘤可以通过手术治愈,但一旦进入快速生长期,它能够迅速扩散到机体多个器官,预后差,死亡率非常高。目前,国际上尚没有系统有效的治疗方案能够延长患者的生存期。所以,深入探讨恶性黑色素瘤的发病机制,寻找基于病因学的潜在分子靶点,对恶性黑色素瘤的治疗具有重要意义。蛋白磷酸化丝/苏-脯氨酸的异构调节是继蛋白磷酸化后一个新的调节机制,主要关系到细胞的增殖与转化。其关键酶——人肽脯氨酰顺反异构酶(Pin1),能够特异识别并催化磷酸化丝/苏-脯氨酸模序发生异构,导致蛋白由顺式变为反式,调节其功能。研究表明,Pinl在多种人类肿瘤中过表达,它参与整合并放大多种致癌信号,被称为肿瘤发生发展的“催化分子”。Bao等人的研究表明,Pin1在恶性黑色素瘤中呈过度表达,但Pin1是否促进了恶性黑色素瘤的发生发展,抑制Pin1是否能抑制恶性黑色素瘤的进程,仍不得而知。因此,本实验中选取恶性度和侵袭转移能力较强的人恶性黑色素瘤A375细胞株作为研究对象,采用人工构建的miRNA质粒特异沉默Pin1基因的表达,从体内、外水平检测了Pin1基因沉默对A375细胞增殖、侵袭转移等能力的影响。首先,通过瞬时转染,用Western Blot方法,从Invitrogen公司提供的4条miRNA质粒中挑选了一条沉默效率最高的质粒—miRNA plas4。继而,通过miRNA plas4稳定转染A375细胞,得到了两株稳定沉默Pin1的单克隆细胞株,相对于稳定转染空载体对照的克隆株—Mock,其沉默效率分别为85%和84%。为了阐明Pin1是否参与了人恶性黑色素瘤的增殖过程,通过体外生长曲线法与肿瘤细胞集落形成实验,观察了沉默Pin1对A375细胞增殖的影响。研究结果表明,稳定沉默Pinl的A375细胞,生长速度明显减慢,集落形成能力也大大降低。这说明Pin1确实对A375的增殖起到了促进作用。另外,流式细胞术检测的细胞周期结果也显示,稳定沉默Pin1的两株克隆,均出现了Go/G1期阻滞。由于恶性黑色素瘤是一种高侵袭转移的肿瘤,也正是由于其高侵袭转移性导致了患者高死亡率及预后不良,所以,为了探讨Pin1是否与恶性黑色素瘤的侵袭转移相关,我们亲本A375细胞、转染空载体的对照细胞—Mock、以及两株稳定沉默Pin1的细胞,进行了体外粘附实验、划痕愈合实验与穿膜试验。结果表明,沉默细胞中的Pin1,可以显著降低A375细胞的异质粘附、运动以及侵袭转移能力。为了在体内水平进一步探讨Pin1的作用,用Mock以及两株稳定沉默Pin1的克隆进行了裸鼠异体移植瘤实验。结果显示,沉默细胞中的Pin1可以显著降低A375细胞在裸鼠体内的致瘤性。最后,为了从分子水平上阐明沉默Pin1所发挥的这些效应,究竟是源于对哪些原癌蛋白的抑制,采用Western Blot的方法,初步检测了一些曾报道或未报道过的与Pin1相关的蛋白的表达情况。结果显示,在稳定沉默Pin1的两株克隆中,与肿瘤恶性增殖、侵袭转移密切相关的pAkt(Ser473)/Akt比值明显降低,JNK水平、MMP-2酶原水平明显降低,而克隆2中原癌蛋白Her2和CyclinDl的表达水平也显著降低。综上所述,Pin1与人恶性黑色素瘤的增殖及侵袭转移密切相关,沉默细胞中的Pin1,可以同时抑制多种与肿瘤恶性增殖、侵袭转移相关的原癌蛋白,从而影响肿瘤的发生发展,Pin1很可能成为一个新的治疗恶性黑色素瘤的靶点。Pin1是1996年在酵母双杂中发现的一种和有丝分裂激酶有相互作用的蛋白。它属于肽脯氨酰顺反异构酶大家族中的微小菌素(Parvulins)亚家族,能够通过识别磷酸化的丝/苏氨酸-脯氨酸模序,导致底物蛋白发生构象改变,进而影响其功能。越来越多的研究表明,Pin1非常有望成为一个抗癌药物研究的新靶点。因此,Pin1抑制剂的研发已成为当今的研究热点。Pin1抑制剂主要分为拟肽类抑制剂和小分子抑制剂两种,由于拟肽类抑制剂很难应用于临床,所以目前研究的主要方向是小分子抑制剂。虽然经过多年来的努力,小分子抑制剂的结构层出不穷,其中有些抑制剂对酶的抑制活性也可以达到纳摩尔水平,但由于理化性质等种种原因,迄今为止,仍没有特异有效的Pin1抑制剂可以进入临床研究。因此,寻找新型结构的小分子Pin1抑制剂至关重要。中国医学科学院药物研究所合成室的徐柏玲老师课题组,根据Pin1酶及其底物的结构特征,结合计算机模拟的分子对接技术,设计合成了一系列完全创新结构的小分子化合物。本论文采用MTT法及成功建立的蛋白酶偶联的PPIase活性检测方法对这些化合物进行了评价,并对其中代号为XP08075的化合物,进行了初步的抗肿瘤作用机制研究。首先,检测了10种不同组织来源的19株肿瘤细胞中Pin1的表达水平。发现,Pin1在人前列腺癌、胃癌、宫颈癌细胞中表达较高,而在人肝癌HepG2中表达最低。因此,选择HepG2细胞作为转染对象,成功构建了Pin1过表达的HepG2肿瘤细胞模型。由于MTT法可以快速评价化合物的体外抗肿瘤作用,所以首先应用MTT法对294个化合物进行了初步筛选。结果表明,49个化合物IC5o在微摩尔水平。继而,在对其中9个化合物进行复筛后我们发现,XP08075对各株肿瘤细胞均有较好的抑制作用,并且肿瘤细胞对XP08075的敏感性与其Pin1表达相关。因此,又进一步检测了XP08075在构建的Pin1过表达HepG2细胞模型上的作用。结果表明,XP08075对过表达Pin1的HepG2细胞的生长抑制作用,明显高于转染空载体的对照细胞。为了从分子水平阐明此类结构的化合物是否在体外能直接抑制Pin1酶的活性,建立了蛋白酶偶联的Pin1活性检测方法,并对包括XP08075在内的51个化合物进行了酶学水平的检测。其中,9个化合物对Pinl酶的IC50达到了微摩尔水平。在溶解性相对较好的情况下,XLN418表现出了较高的Pinl抑制活性,IC50为4.9μmol/L,但XP08075对酶的抑制作用不强。在分析比较了细胞、分子水平有效的化合物的结构特征之后,发现,绝大多数细胞水平有作用的化合物,取代基都是酯,而酶学水平有作用的化合物,取代基都是羧酸。XLN418和XP08075的唯一区别是,R3取代基,XLN418是甲酸而XP08075是甲酯。另两对化合物也出现了同样的情况。因此推测,含酯键的化合物在进入细胞后,可能部分被酯酶水解变成了带羧酸的化合物,通过抑制Pin1的活性而发挥其抗肿瘤作用。而含羧酸的化合物,由于极性大不容易透过细胞膜,所以在细胞水平没有抑制活性。基于上述推测,以人乳腺癌细胞MCF-7为研究对象,对XP08075的抗肿瘤机制进行了初步探讨。流式细胞术的结果显示,6μmol/L的XP08075作用于MCF-724、48和72h,不会对周期分布产生明显影响,只是在作用72h后出现了轻微了Go/G1期比例的增加。根据生长曲线计算得到的细胞倍增时间显示,6μmol/L的XP08075可以显著增加MCF-7细胞的倍增时间,导致整个细胞周期进程的延长。继而,通过VVestern Blot法检测了XP08075处理MCF-7细胞后,细胞内相关蛋白的变化。我们观察到,Pin1间接调控的β-catenin以及CyclinBl的蛋白表达出现了时间依赖性下降。但同时,Pin1的蛋白含量也出现了明显降低。通过相同条件处理细胞,RT-PCR分析,我们发现,这种蛋白表达的降低很大程度上是源于Pin1降解的增多。因此,XP08075可能经过细胞内的酯解,部分变成了XLN418,通过对Pin1蛋白及活性的抑制,发挥其抗肿瘤作用。综上所述,XLN418有望成为Pin1抑制剂的一个先导化合物,为该类结构Pin1抑制剂的研究奠定了基础。XLN306是我所徐柏玲老师课题组合成的新型结构小分子化合物,旨在研究以Pin1为靶点的抗肿瘤药物。前期研究结果表明,XLN306虽然没有很强抑制Pin1酶的活性,但对不同肿瘤细胞均有较好的生长抑制作用,IC50在微摩尔水平,其中对人乳腺癌MX-1的生长抑制作用相对较强。因此,本研究采用MX-1作为体外研究对象,旨在探讨XLN306较确切的抗肿瘤作用机制。首先,我们以细胞周期为切入点,检测了XLN306对MX-1细胞周期分布的影响。结果显示,XLN306可使细胞出现剂量依赖及时间依赖性的凋亡增加。提示XLN306的抗肿瘤作用,很可能源于其诱导凋亡作用。为了深入探讨其诱导凋亡的机制,我们从体内、外水平,针对凋亡的不同途径及作用环节进行了较系统深入地研究。通过DAPI染色法及DNA ladder实验,本研究从形态学及生物化学的角度观察到,XLN306可以诱导MX-1细胞凋亡,出现明显的染色质浓缩和核碎裂现象,细胞内核小体DNA断裂呈现典型的梯形条带。Western Blot结果表明,XLN306可以通过上调Fas和FasL的表达,降低Bcl-2/Bax比例、促进细胞色素C的释放,同时启动死亡受体通路和线粒体通路这两条经典的凋亡通路,进一步活化Caspase3,导致凋亡的发生。另外,20μmol/L的XLN306还可以明显抑制肿瘤细胞存活通路中重要蛋白Akt的磷酸化,通过下调Akt的活性,活化GSK3β,从而促进凋亡的发生。为了从体内水平探讨XLN306的抗肿瘤作用,进行了小鼠肝癌H22移植瘤实验。结果显示,XLN306可以显著抑制移植瘤的生长,且具有很好的量效关系。综上所述,体内、外研究均表明,XLN306具有良好的肿瘤生长抑制作用,其机制与同时启动死亡受体、线粒体通路,诱导细胞凋亡有关。