紫甘薯多糖的分离纯化、结构表征及其抗炎特性研究

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天然多糖具有复杂的化学结构和多方面的生物活性,受到人们的广泛关注,已成为食品化学、天然产物化学等领域的研究热点。近年来,从植物等天然资源分离的活性多糖展现了良好的抗氧化、调节免疫、调节肠道菌群以及抗癌等活性,对维护机体健康、预防和治疗相关疾病具有重要意义。膳食能够调节肠道菌群的组成和功能,影响肠道菌群的代谢产物,进一步影响宿主的免疫响应和炎症反应。‘徐紫薯3号’是由中国农业科学院甘薯研究所选育的高花青素鲜食型甘薯品种,富含生物活性物质,是一种天然的功能性食物资源,具有重要的食用价值。本研究以‘徐紫薯3号’紫甘薯为实验材料,依次通过水提法、碱提法和分离纯化,获得了高纯度均一的紫甘薯水溶性多糖(PSWP-I)和碱溶性多糖(PSAP-I),并分析了其结构特性;通过体外体内实验明确了紫甘薯多糖的抗炎特性;分析了紫甘薯多糖对肠炎模型小鼠肠道菌群及肠道代谢化合物的影响,旨在探讨紫甘薯多糖基于肠道菌群调节小鼠肠道炎症的可能机制,以期为紫甘薯多糖膳食补充剂的开发利用提供理论依据。(1)为了明确紫甘薯水溶性多糖的结构特性及体外细胞抗炎活性,通过水提法以及Cellulose DEAE-52、Sephadex G-100柱层析分离纯化制备得到紫甘薯水溶性多糖(PSWP-I),采用甲基化反应、GC-MS和NMR等方法解析了PSWP-I的化学结构,利用脂多糖(LPS)诱导的炎症RAW264.7巨噬细胞分析了体外抗炎活性。结果表明,紫甘薯水溶性多糖(PSWP-I)是高纯度的均一性多糖组分,其相对分子质量为103 kDa,单糖组成为葡萄糖和甘露糖,PSWP-I主链由→4)-α-D-Glcp-(1→、→6)-α-D-Glcp-(l→、→2)-α-D-Manp-(1→组成,T-β-D-Glcp-(1→残基位于侧链,并通过 O-6 与→ 4)-α-D-Glcp-(1→连接,为线性结构多糖。PSWP-I提高RAW264.7巨噬细胞的细胞活力,显著降低炎症RAW264.7巨噬细胞的一氧化氮(NO)分泌量,显著抑制肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)的分泌水平,显著提高白细胞介素10(IL-10)的分泌水平,同时一定程度上修复炎症RAW264.7巨噬细胞的形态。紫甘薯水溶性多糖(PSWP-I)的体外细胞抗炎活性研究结果,可为其后续动物体内抗炎特性及作用机制等方面的研究提供依据。(2)为了明确紫甘薯碱溶性多糖的结构特性及体外细胞抗炎活性,对上述水提后的残渣,通过碱提法以及Cellulose DEAE-52、Sephadex G-200柱层析分离纯化制备得到紫甘薯碱溶性多糖(PSAP-I),采用甲基化反应、GC-MS和NMR等方法解析了PSAP-I的化学结构,利用脂多糖(LPS)诱导的炎症RAW264.7巨噬细胞分析了体外抗炎活性。结果表明,紫甘薯碱溶性多糖(PSAP-I)是高纯度的均一性多糖组分,其相对分子质量为180kDa,单糖组成为葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖,PSAP-I的主链为→4)-α-D-Glcp-(1→,T-α-D-Manp-(1→、T-α-D-Rhap-(1→、T-α-L-Araf-(1→和T-β-D-Glcp-(1→残基位于侧链,并通过O-6与主链连接,为复杂的多支链结构多糖。PSAP-I提高RAW264.7巨噬细胞的活力,显著降低炎症RAW264.7巨噬细胞的NO分泌量,显著抑制TNF-α、IL-6的分泌水平,显著提高IL-10的分泌水平,同时一定程度上修复炎症RAW264.7巨噬细胞的形态。紫甘薯碱溶性多糖(PSAP-I)的体外细胞抗炎活性研究结果,可为其后续动物体内抗炎特性及作用机制等方面的研究提供依据。(3)为了明确紫甘薯水溶性多糖(PSWP-I)和碱溶性多糖(PSAP-I)对肠炎小鼠肠道炎症的调节作用,利用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠肠炎模型,研究了紫甘薯多糖(PSWP-I、PSAP-I)的体内抗炎特性。结果表明,紫甘薯多糖显著提高肠炎小鼠胸腺指数、降低脾脏指数;显著抑制肠炎小鼠结肠组织TNF-α、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6的分泌量、提高IL-10的分泌量;显著降低肠炎小鼠肝组织丙二醛(MDA)含量、增强超氧化歧化酶(SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)水平。其中,紫甘薯水溶性多糖干预组(DSS+PSWP-I)比碱溶性多糖干预组(DSS+PSAP-I)更显著降低小鼠的脾脏指数,显著提高SOD活性和T-AOC水平。白细胞介素6(IL-6)的分泌量,紫甘薯碱溶性多糖干预组(DSS+PSAP-I)比水溶性多糖干预组(DSS+PSWP-I)下降更明显。结肠病理学显示,DSS模型组小鼠的结肠长度明显缩短,出现严重的结肠炎,而紫甘薯多糖能明显恢复肠炎小鼠的结肠长度,减轻病理损伤。以上结果说明,紫甘薯多糖(PSWP-I、PSAP-I)的干预对DSS诱导的肠炎小鼠胸腺和脾脏等免疫器官、肝脏酶促抗氧化防御体系及抗氧化能力都具有良好的保护作用。PSWP-I和PSAP-I都显现出良好的动物体内抗炎特性以及对机体的免疫保护作用,具有较高的开发利用价值。(4)为了明确紫甘薯水溶性多糖(PSWP-I)和碱溶性多糖(PSAP-I)对肠炎小鼠肠道菌群的调节作用以及肠道菌群与炎症因子的关联性,分析了紫甘薯多糖(PSWP-I、PSAP-I)对DSS诱导的肠炎小鼠肠道菌群多样性、相似度、组成差异性的影响,以及肠道菌群与炎症因子、短链脂肪酸的相互关系。结果表明,紫甘薯水溶性多糖(PSWP-I)和碱溶性多糖(PSAP-I)显著上调肠炎小鼠门水平厚壁菌门菌群的相对丰度,下调拟杆菌门、变形杆菌门菌群的相对丰度;显著上调科水平毛螺旋菌科、乳杆菌科、双歧杆菌科菌群的相对丰度,下调拟杆菌科、葡萄球菌科、莫拉氏菌科菌群的相对丰度;显著上调属水平乳杆菌属、毛螺旋菌科未确定属、双歧杆菌属等菌群的相对丰度,下调属水平拟杆菌属、葡萄球菌属、嗜冷杆菌属等菌群的相对丰度。进一步分析DSS vs.NC菌群集、DSS+PSWP-I vs.DSS菌群集与DSS+PSAP-I vs.DSS菌群集共有的肠道菌群差异性发现,紫甘薯水溶性多糖(PSWP-I)的干预显著上调乳杆菌属、毛螺旋菌科未确定属、Aerococcus、Enterorhabdus、LachnospiraceaeUCG-001、Faecalibaculum、Anaerovorax等菌群的相对丰度,显著下调拟杆菌属、葡萄球菌属、嗜冷杆菌属、理研茵 属、RuminococcaceaeUCG-014、Odoribacter、Corynebacterium1、norankfClostridiales vadinBB60group、unclassifiedoBacteroidales、norankfRhodospirillaceae等菌群的相对丰度;紫甘薯碱溶性多糖(PSAP-I)的干预显著上调乳杆菌属、毛螺旋菌科未确定属、PrevotellaceaeUCG-001、Aerococcus、LachnospiraceaeUCG-001、Faecalibaculum、Anaerovorax、Gemella 等菌群的相对丰度,显著下调拟杆菌属、葡萄球菌属、嗜冷杆菌属、理研菌属、RuminococcaceaeUCG-014、Odoribacter、Corynebacterium1、norankfClostridialesvadinBB60group、unclassifiedoBacteroidales、norankfRhodospirillaceae 等菌群的相对丰度。其中拟杆菌属、unclassifiedoBacteroidales与促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)显著正相关的同时与短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)显著负相关;norankfClostridialesvadinBB60group与促炎因子显著正相关的同时与抗炎因子(IL-10)显著负相关;LachnospiraceaeUCG-001与促炎因子显著负相关的同时与抗炎因子、短链脂肪酸显著正相关;Gemella与促炎因子显著负相关的同时与抗炎因子显著正相关;理研菌属与抗炎因子显著负相关;Enterorhabdus与短链脂肪酸显著正相关;乳杆菌属、双歧杆菌属与抗炎因子正相关,Odoribacter与抗炎因子负相关。紫甘薯多糖(PSWP-I、PSAP-I)显著提高肠炎小鼠肠道乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸的含量。以上结果说明,紫甘薯多糖的干预能够调节DSS诱导的肠炎小鼠紊乱的肠道菌群组成和比例,并使其得到一定的恢复。紫甘薯多糖通过刺激肠炎小鼠肠道中产短链脂肪酸的相关代谢微生物生长,从而产生较多的乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸,可能为结肠上皮组织提供更多能量,调节结肠上皮细胞和免疫细胞的生长和凋亡,提高抗炎性能。(5)为了明确紫甘薯水溶性多糖(PSWP-I)和碱溶性多糖(PSAP-I)对肠炎小鼠肠道代谢化合物的调节作用以及肠道代谢化合物与肠道菌群、炎症因子的关联性,研究了紫甘薯多糖(PSWP-I、PSAP-I)对DSS诱导的肠炎小鼠肠道代谢化合物及代谢通路的影响,分析了肠道代谢化合物与肠道菌群、炎症因子的相互关系。结果表明,紫甘薯水溶性多糖的干预(DSS+PSWP-I)显著改变肠炎小鼠12种肠道代谢化合物,其中6种化合物与炎症因子关联。紫甘薯水溶性多糖(PSWP-I)显著上调肠炎小鼠肠道中的5’-脱氧腺苷和黄烷酮的丰度,而这2种肠道代谢化合物与促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)显著负相关;显著下调17-羟孕酮、艾菊酮A、油酸和五针松素4种肠道代谢化合物的丰度,而这4种化合物与促炎因子显著正相关。结果说明,这6种肠道代谢化合物可能与紫甘薯水溶性多糖(PSWP-I)的抗炎特性密切相关。紫甘薯碱溶性多糖的干预(DSS+PSAP-I)显著改变肠炎小鼠18种肠道代谢化合物,其中15种化合物与炎症因子关联。紫甘薯碱溶性多糖(PSWP-I)显著上调肠炎小鼠肠道中的贻贝抗菌肽A、24S-OH-7-DHC、1-羟维生素D3吡喃葡萄糖苷、3-羟基十五酰基肉碱、黄酮7-甲醚、香叶木素和牛磺鹅胆酸-3-硫酸7种肠道代谢化合物的丰度,而这些7种化合物与促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)显著负相关;显著下调17-羟孕酮、去甲丙咪嗪、顺-7-十六烯酸、(S)-α-氨基-4-羧基-3-呋喃丙酸、5-甲氧基二甲基色胺、油酸、神经酰胺和溶血磷脂酰乙醇胺8种肠道代谢化合物的丰度,而这8种化合物与促炎因子显著正相关。结果说明,这些15种肠道代谢化合物可能与紫甘薯碱溶性多糖(PSAP-I)的抗炎特性密切相关。与抗炎或促炎代谢化合物呈现显著相关性的肠道菌有15种,其中与紫甘薯水溶性多糖(PSWP-I)显著关联的肠道菌有拟杆菌属、理研菌属、norankfClostridiales vadinBB60group、unclassifiedo Bacteroidales、LachnospiraceaeUCG-001;与紫甘薯碱溶性多糖(PSAP-I)显著关联的肠道菌有拟杆菌属、理研菌属 norankfClostridiales vadinBB60group、unclassifiedoBacteroidales、Lachnospiraceae UCG-001、Gemella。紫甘薯多糖(PSWP-I、PSAP-I)显著改变结肠炎小鼠的角质、软木脂和腊质生物合成、不饱和脂肪酸合成、脂肪酸合成、类固醇激素合成4个脂类代谢通路。以上结果说明,肠道菌群、肠道代谢化合物、炎症因子关系密切,紫甘薯多糖(PSWP-I、PSAP-I)可能通过改善DSS诱导的肠炎小鼠的肠道菌群丰度,优化肠道代谢化合物,进而正向影响结肠炎症因子,发挥其抗炎作用。
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