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研究背景:近年，随着对细胞周期调控机理研究的不断深入，人们逐渐认识到细胞周期失控在肿瘤发生和发展中的作用。正常细胞周期的进行依赖于多种细胞周期调节蛋白的协调性作用，其中，cyclinD1和CDK4是控制细胞周期G1期向S期转变的关键性调节因子，其异常表达可破坏细胞周期调控的稳态平衡，与细胞转化或肿瘤的发生密切相关。有丝分裂素活化蛋白激酶(MAPKs)可通过多种途径促进cyclinD1蛋白表达或调节cyclinD1-CDK4复合物的活性，该通路的异常活化与多种细胞恶性转化及多种人类肿瘤发生有关。研究表明，B[a]P可引起多种细胞内MAPK通路活性的增加和细胞增殖效应。另有研究结果表明，B[a]P可显著影响多种细胞的细胞周期分布。但是，目前对MAPK信号通路、cyclinD1及CDK4在B[a]P诱导的细胞周期改变中的调节机理还不清楚。
研究目的:本实验利用人胚肺成纤维细胞(HELF)为研究对象，对MAPK信号转导通路、cyclinD1及CDK4分别在B[a]P诱导的HELF细胞周期改变过程中的作用进行分析，同时我们还验证了MAPKs信号通路之间及MAPK通路与cyclinD1蛋白表达之间的相互关系，以期从细胞信号通路及细胞周期调节蛋白水平研究B[a]P致细胞周期改变及其潜在的致癌作用机理。
研究内容与方法:
1.采用反义RNA技术，将反义cyclinD1cDNA和反义CDK4cDNA分别导入HELF细胞内，并建立稳定转染的细胞系，通过westernblots蛋白印迹法，观察了反义cyclinD1和反义CDK4对细胞内cyclinD1和CDK4蛋白表达的抑制作用，并分别观察了B[a]P对HELF细胞内ERK1/2、JNK1/2及p38蛋白激酶活性、cyclinD1及CDK4蛋白表达的影响。
2.使用特异性化学抑制剂分别抑制ERK1/2、JNK1/2及p38蛋白激酶活性，观察这三种MAPK相互作用关系及在B[a]P诱导的cyclinD1蛋白过表达过程中的作用。
3.采用Flowcytometry流式细胞术，观察了B[a]P对HELF细胞周期的影响；通过使用特异性化学抑制剂分别抑制ERK1/2、JNK1/2及p38蛋白激酶活性，观察这三种MAPK在B[a]P诱导的HELF细胞周期改变中的作用；
4.采用流式细胞术，观察了反义cyclinD1和反义CDK4在B[a]P诱导的HELF细胞周期进程中的作用。采用SPSS10.0软件包，以统计学两样本t检验对细胞周期数据进行两两组间比较，以p值≤0.05为统计学上有显著性差异。
研究结果:
1.建立了分别表达反义cyclinD1RNA及反义CDK4RNA的HELF细胞模型：反义pXJ41-cylinD1转染的HELF细胞(简称反义D1细胞)，反义pXJ41-CDK4转染的HELF细胞(简称反义K4细胞)和pXJ41空载体转染的HELF细胞(简称pXJ细胞)。
2.不同剂量B[a]P刺激HELF细胞24h，引起ERK1/2、JNK1/2及p38蛋白激酶活性的明显增加；使用特异性化学抑制剂抑制某一种MAPK活性，对其他两种蛋白激酶活性无明显影响；2.5uMB[a]P分别刺激细胞3h、6h、12h、24h及48h后可引起三种MAPK的持续活化。
3.B[a]P可诱导cyclinD1蛋白表达的持续增加，但是对CDK4蛋白表达无明显影响；抑制ERK1/2活性可完全抑制B[a]P刺激引起的cyclinD1蛋白过表达，抑制JNK1/2或p38活性对B[a]P诱导的cyclinD1蛋白过表达无显著影响。
4.2.5μMB[a]P刺激HELF细胞24h，细胞周期发生明显变化，与对照组比较，G1期细胞数减少了11.9％(p＜0.05)，S期细胞数增加了17.2％(p＜0.05)；抑制ERK1/2、JNK1/2或p38蛋白激酶活性后，均可显著抑制B[a]P诱导的细胞周期进程。
5.与HELF细胞相比，反义cyclinD1细胞内的CDK4蛋白本底值有所降低，而反义CDK4细胞内cyclinD1蛋白表达则有所增加。
6.2.5μMB[a]P分别刺激反义D1细胞及反义CDK4细胞24h后，细胞周期G1期和S期分布未发现明显改变。
研究结论1.B[a]P可明显激活HELF细胞内ERK1/2、JNK1/2及p38通路活性，并可引起三种MAPK通路的持续性活化。
2.B[a]P可诱导HELF细胞内cyclinD1蛋白过表达，对CDK4蛋白表达无显著影响。
3.B[a]P可缩短HELF细胞由G1期转变到S期所需时间，促进细胞由G1期进入到S期。
4.ERK1/2、JNK1/2及p38信号通路各自独立地正性调节B[a]P诱导的HELF细胞周期进程。
5.ERK1/2通路正性调节B[a]P诱导的cyclinD1蛋白过表达，JNK1/2及p38通路无此作用。
6.CyclinD1蛋白是B[a]P诱导的HELF细胞周期进程中的正性调节因子，CDK4蛋白本底值表达在B[a]P诱导的HELF细胞周期进程中也起重要作用。
综上所述，B[a]P刺激可导致ERK1/2、JNK1/2和p38通路活性的明显增加，三种MAPK信号通路均正性调节B[a]P诱导的HELF细胞周期进程，同时，B[a]P刺激还导致ERK1/2通路依赖的cyclinD1蛋白过表达，抑制cyclinD1和CDK4蛋白表达可明显阻滞B[a]P促进的HELF细胞周期的进程。本研究结果丰富了B[a]P致细胞周期调控紊乱的分子机制研究，同时也为进一步研究MAPK、cyclinD1及CDK4在B[a]P致癌分子机理中的作用提供理论依据。