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细胞代谢是一切生命活动的基石，然而系统地阐述细胞内代谢途径的复杂整合和潜在的调控机制一直都是研究难题。遗传编码的荧光探针以其强大的实时追踪细胞代谢的能力，成为了解决这个难题的有效手段。本文中，我们使用不同的设计策略开发出三种新的荧光探针，并详细描述了它们在单细胞和活体水平的应用。 NADPH为细胞内的还原性生物合成反应以及抗氧化功能提供还原力，但是在活细胞中时空特异性检测NADPH仍然非常困难。本文中我们开发了一系列遗传编码的NADPH探针，称之为iNap。探针拥有比例型的荧光变化，pH相对不敏感性，对底物不同的亲和力以及较大的动态响应范围。iNap生物传感器允许对胞浆和线粒体基质中的NADPH库进行定量，并证明它们受到胞浆NADK活性的调节。这个探针还揭露了氧化应激下，细胞内NADPH的动态依赖于葡萄糖的可用性。我们发现癌细胞有很强的维持生理NADPH稳态的倾向，这个过程受到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)和AMP激酶(AMPK)的控制。此外，我们发现一种生理性的甾类激素脱氢表雄酮(DHEA)，它原本是广为接纳的G6PD抑制剂。实际上，它还能够激活AMPK途径，改道NADPH消耗途径到抗氧化功能，因而可以维持葡萄糖存在条件下氧化应激细胞的NADPH库水平并保护细胞免受氧化损伤。但是在饥饿的条件下，它却会抑制G6PD活性并排空NADPH库。此外，我们还证明iNap探针是能够追踪巨噬细胞激活或活体受伤反应中NADPH变化的宝贵工具，并为细胞代谢增加新的见解。 区室化分布的pH是调节细胞功能的关键参数。本文我们开发出一个异常灵敏且具有比例型荧光的pH探针，称之为pHluorin3，它有着明亮的荧光和增强的响应范围。这个强有力的pH报告子可以定量校准不同亚细胞器的质子浓度。利用该探针，我们可以时空特异性地观察HeLa细胞中快速且可逆的酸化和碱化过程。另外，与一个红色的过氧化氢生物传感器联用，pHluorin3揭露了氧化应激条件下胞浆和线粒体的pH变化，同时允许真实的观察过氧化氢的动态变化。这个异常敏感的光学工具将会提供过往方法难以观察到的氢离子波动的更多信息。 工程化荧光探针用于观察汞离子动态是描述其细胞毒性的强大工具。但是，目前在活细胞中敏感且特异性地检测无机汞离子是非常困难的。在本文中我们通过将环状变换荧光蛋白插入到汞离子高度特异性的阻遏蛋白MerR中成功开发了两个绿色增强的比例变化型探针，以及第一个红色荧光强度测量型的探针。这些嵌合蛋白，称之为GEIM，允许实时观测溶液，细菌，哺乳动物不同亚细胞器以及斑马鱼中的汞离子变化。它和绿色的过氧化氢探针HyPer联用，我们在单细胞水平上观察到汞离子进入细胞会刺激胞浆和线粒体产生氧化应激。这个GEIM染料盒将会帮助描绘汞离子对细胞毒性的全景图。 总而言之，我们展现了三种性质稳健的光学生物传感器的开发和使用过程。这些探针允许时空特异性观察代谢动态，并揭示其精细的调控机制。我们希望本篇学位论文可以对荧光探针和细胞代谢领域的研究有所启发。