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为了在核酸水平上了解我国侵染花生的两种Cucumoviruses病毒的遗传、变异和进化,本文完成了我国花生矮化病毒-轻型株系(Peanut stunt viru mild strain,PSV-Mi)、黄瓜花叶病毒-花生普通株系(Cucumber mosaic virus common strain,CMV-CA)和强毒力株系(CMV-CS)基因组全序列分析,并将PSV-Mi和CMV-CA复制酶基因片段和PStV外壳蛋白(cp)基因构建了病毒单抗和多抗植物表达载体,通过转化烟草,明确抗性效果,为以后转花生抗病毒育种提供理论依据。具体结果如下: PSV-Mi株系RNA1、2和3全长分别为3347个核苷酸(nt)、2966nt和2170nt,3个RNA组分大小和结构与已经报道的PSV株系一致。核酸序列同源性比较结果表明,PSV-Mi株系RNA1、2和3与国外报道的PSV-ER(亚组Ⅰ)和PSV-W(亚组Ⅱ)株系序列同源性都低于80%;与同属的CMV和番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)代表株系都低于70%。以上结果表明以PSV-Mi为代表的中国PSV株系独自构成一个PSV新亚组,即亚组Ⅲ。4个ORFs的系统进化树也表明,PSV-Mi、ER和W株系各自形成独立的进化分枝,进一步证实上述结论。 CMV-CA和CS株系RNA1和2长度相同,分别为3356nt和3045nt;RNA3长度相差7nt,分别为2217利2212nt。CMV-CA与CS的RNA1、2和3核苷酸序列同源性分别为:98%、99%和97%。两个株系3个RNA组分与CMV亚组Ⅰ核苷酸序列的同源性达90%左右,与CMV亚组Ⅱ株系低于80%,与PSV-ER低于70%。上述序列同源性比较结果表明:CMV-CA与CS株系亲缘关系最近;二者与CMV株系的亲缘关系较近,与同属PSV株系亲缘关系较远;CMV株系中,与亚组Ⅰ株系亲缘关系较近,与CMV亚组Ⅱ株系亲缘关系较远。5个ORF核苷酸序列及编码的蛋白质氨基酸序列同源性比较,得到相同的结论。 RNA3的5’端非编码区(NTR)核苷酸序列结构分析表明:CMV-CA利CS与CMV亚组IB株系结构特征相似,与CMV亚组IA和Ⅱ株系结构特征明显不同。5个ORFs核苷酸序列系统进化树分析表明,CMV-CA和CS亲缘关系最近,都分布于CMV-IB亚组。上述分析均证实我国花生CMV-CA和CS两个毒力不同的株系均属于CMV-IB亚组。尽管CMV和PSV在同一区域花生上发生,上述研究未发现二者之间RNA组分的重组合(reassortment),因此,CMV-CA和CS株系是我国特定的生态条件下,CMV发生遗传变异的结果。 针对PStV、PSV利CMV在同一区域花生上流行,应用3种病毒CP或复制酶基因片段构建病毒单抗和多抗植物表达载体,包含PStVcp基因的pKcp载体和3种病毒cp或复制酶基因150bp(或500bp大小片段)拼接片段的反向重复序列载体pK450和pK1500。借助于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101(pMP90)转化白氏烟(Nicotiana benthamiana),经过PCR检测,获得转基因植株。pKcp T0-T2代转基因烟草都获得对PStV不同程度的抗性。pK450和pK1500 T1代植株对PStV表现不同程度的抗性,对CMV均有一个系表现症状恢复抗性,对PSV全部感病。siRNA的Northern blot结果表明,所有转化的烟草植株都含有不同量的病毒siRNA。 3种载体都获得对PStV的抗性,说明PStVcp从150bp片段到完整cp基因都能有效诱导对PStV的抗性;pK450和pK1500载体都有一个系同时获得对PStV和CMV的抗性,表明应用RNA沉默策略可获得对这两种病毒的抗性。本项研究为针对3种花生病毒的单、多抗转基因花生的育种作了有益的尝试,目前正进一步构建新的载体,以增强对CMV和PSV抗性的表达。