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研究背景：卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，目前主要的治疗方法是采用手术，而患者的术后5年生存率只有25%-30%。高致死率的主要原因是卵巢癌的转移和复发，其中关键因素是肿瘤的新生血管的生成，除了目前公认的VEGF(vascular endothelialgrowth factor,血管内皮生长因子)是促进肿瘤血管生成的重要因素外，多种来源的内皮细胞(如肿瘤起源的血管内皮细胞、血循环中的内皮细胞等)也是促进肿瘤血管形成的重要因素。EPCs(endothelial progenitor cells,内皮祖细胞)是成熟内皮细胞的前体细胞，可以分化为内皮细胞并参与血管生成，EPCs亦成为肿瘤血管生成的一个重要因素，因此EPCs的研究对肿瘤血管生成和血管生成抑制有重要的意义。鉴于EPCs的表面标志物及分化特性，有望可以通过抑制EPCs参与肿瘤血管生成而降低肿瘤的转移和复发，提高肿瘤患者的生活质量和生存率。本研究通过阻断VEGF作用于EPCs，探讨卵巢癌细胞株SKOV3对EPCs成管以及其相关蛋白表达的影响，为探讨EPCs成血管的机制提供实验依据。研究目的：探讨内皮祖细胞的脐血分离、培养及鉴定方法，为EPCs相关实验奠定基础。利用不同量的VEGF抗体作用于卵巢癌细胞SKOV3与EPCs的共培养体系，观察其对EPCs成管和蛋白MMP-2(matrix metalloproteinase-2,基质金属蛋白酶-2)、MMP-9(matrixmetalloproteinase-9，基质金属蛋白酶-9)的表达影响，深入了解VEGF抗体和EPCs的成血管作用之间的关系，为以后进一步的EPCs的体内实验提供依据。材料和方法：1.人脐带血内皮祖细胞的分离、鉴定及培养征得产妇知情同意后，取健康足月顺产或剖宫产产妇的脐带血，与万汶6:1混匀，采用密度梯度离心法分离单核细胞，并接种于6孔板中，观察细胞贴壁生长和形成细胞集落的情况；每隔2天换液一次，每隔7天拍照记录一次细胞形态变化。细胞培养第7天时，采用FITC-UEA-1和DiI-acLDL双吞法、免疫荧光及流式细胞仪检测细胞表面标志物的方法，进一步鉴定EPCs。2.卵巢癌细胞SKOV3培养和EPCs非接触共培养体系的建立在EPCs培养至第8天时，在6孔板中放入孔径为0.4μm的Transwell小室，并在上室接种SKOV3细胞。在共培养体系建立的第1天就加入不同量的VEGF抗体，并将实验分为5组，分别是： EPCs单独培养组、 EPCs+SKOV3共培养组、EPCs+SKOV3+25μgVEGF抗体共培养组、EPCs+SKOV3+50μgVEGF抗体共培养组、EPCs+SKOV3+100μgVEGF抗体共培养组。2天后解除共培养系统，消化各组EPCs进行下一步实验。3.EPCs成管特性的测定和MMP-2、MMP-9的表达情况将各组中的EPCs接种在Matrigel基质胶中，放入37℃培养箱培养，24h后在倒置显微镜下观察各组EPCs成管数目。通过western-blot和RT-qPCR方法观察各组EPCs的MMP-2和MMP-9表达情况。主要结果：1.人脐带血内皮祖细胞的分离、鉴定及培养单核细胞接种后第1天光镜下观察，已有少量细胞贴壁变形，大多数细胞仍然呈漂浮状态，培养3天后观察可发现部分细胞已经贴壁变形、细胞变大、透亮度增加并且呈梭形形态。培养至14天后细胞大部分变为较大的圆形，类似“铺路石”形态，仅存少量梭形细胞。FITC-UEA-1和DiI-acLDL双吞染色，细胞分别呈现绿色荧光和红色荧光，FITC-CD34、FITC-CD133、PE-VEGFR2荧光抗体检测细胞表面标志物，细胞分别显现绿色荧光、绿色荧光和红色荧光；流式细胞仪检测阳性表达率分别为(2.65±0.48%)、(19.40±6.35%)、(64.01±1.07%)。2.卵巢癌细胞SKOV3培养和非接触共培养体系的建立卵巢癌细胞SKOV3复苏接种后，生长状态良好，细胞贴壁后呈现梭形状态，当细胞镜下融合80%-90%可以顺利传代。非接触共培养体系建立后，可以在光镜下分别观察两种细胞生长情况，两种细胞没有发生相互接触混合，各实验组细胞生长状态良好，共培养体系建立成功。3. EPCs成管特性的测定和MMP-2、MMP-9的表达情况EPCs单独培养组的成管腔数目明显较共培养组少(P<0.05),EPCs+SKOV3+25μgVEGF抗体共培养组、EPCs+SKOV3+50μgVEGF抗体共培养组,EPCs+SKOV3+100μgVEGF抗体共培养组成管腔数目均较共培养组少(P<0.05)，且各组之间随着VEGF抗体量的增加而呈现管腔数目逐渐减少的趋势。RT-qPCR及Western blot结果显示:EPCs单独培养组的MMP-2和MMP-9mRNA表达量和蛋白表达量明显较共培养组低(P<0.05), EPCs+SKOV3+50μgVEGF抗体共培养组、EPCs+SKOV3+100μgVEGF抗体共培养组的MMP-2mRNA和蛋白表达量均较共培养组低(P<0.05),EPCs+SKOV3+100μgVEGF抗体共培养组的MMP-9mRNA和蛋白表达量均较共培养组低(P<0.05)。结论：上述实验结果表明，采用密度梯度离心法可以从人脐带血中成功分离出EPCs，经鉴定后可以证实是EPCs，细胞的功能和成管腔的特性保持良好。本实验所采用的EPCs分离方法为今后从人脐带血快速分离得到EPCs提供了技术方法，同时也积累了一定的实验经验。本实验中成功建立了EPCs和卵巢癌细胞的非接触共培养体系，通过加入不同的量的VEGF抗体与对照组比较发现，VEGF抗体可以抑制共培养后EPCs的体外二维管腔样结构的形成，同时下调了MMP-2和MMP-9的表达。结果表明SKOV3细胞可能通过分泌VEGF作用于EPCs，使其MMP-2、MMP-9表达上调，进而促进了EPCs成血管，为进一步研究EPCs促进肿瘤血管生成的机制提供实验依据和基础。